贵州地方红米品种的遗传多样性分析

杨 翠， 刘 凯， 谈红艳， 余显权， 周丽洁

(贵州大学农学院， 贵阳 550025)

世界三大主要粮食作物之一的水稻在我国有着良好的驯化基础，目前世界近一半的人口把稻米作为主食[1]。长久以来，农业科研工作者不断利用和改造原有资源使水稻的品种不断改良，但同时也带来了水稻品种同质化趋势日益明显、遗传多样性下降的问题[2-3]。遗传多样性是水稻遗传改良的基础，地方水稻种质资源因其独有的地域适应性优势及丰富的遗传多样性逐渐成为育种家们选育突破性品种和发掘优质基因的重要种质材料[4-5]。

随着生活水平的日益提高，人们对稻米的色、香、味及营养成分均有了更高的要求。现代饮食高油高脂的特点使高血压、肥胖症等富贵病成为常态，进而使我国中医理念(药食同用、医药同源)得到了老百姓们的重视。红米作为一种富含生物碱、微量元素和维生素类物质的特色水稻在养身方面的作用得到了广大消费者的青睐[6-7]。贵州地理生态环境多样，蕴藏着丰富的有色稻种资源，经全国编目的贵州有色稻资源占贵州地方稻种资源的20.5%[8]，其中红米水稻占多数，且多集中在籼型粘稻[9]。了解地方红米种质资源的遗传多样性是其高效利用和有利挖掘的前提，本研究旨在对现有的147份贵州地方红米水稻资源进行遗传多样性分析，以期了解贵州红米水稻遗传多样性的特点，明确各种质间的亲缘关系，为有效利用贵州地方红米种质资源和新品种的选育提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

本研究所用的147份红米地方品种由贵州省农作物品种资源研究所提供，材料名称和来源见表1。

表1 供试材料的名称及来源Table 1 Names and sources of the tested materials

1.2 水稻基因组DNA的提取

以实验室发芽所得水稻幼苗为材料，提取基因组DNA。取单苗加入液氮后碾碎，装入2 mL离心管中，随后加入预热的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，采用经典CTAB法提取水稻幼苗基因组DNA。检测质量后加入适量的ddH2O稀释成DNA母液，置于-20 ℃冰箱中保存。

1.3 引物的筛选、PCR扩增及电泳

选取均匀分布于水稻12条染色体上、相互间不连锁的56对SSR引物(每条染色体上至少4个)，委托上海Invitrogen公司合成。PCR反应体系为10 μL：2 μL模板 DNA(30～50 ng·μL-1)，10×PCR Buffer(含Mg2+)1.2 μL，dNTP 0.2 μL，5 U·μL-1Taq酶0.1 μL，正反向引物各1 μL，ddH2O 4.5 μL。扩增程序为95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，55～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环，72 ℃延伸10 min，降温至4 ℃后取出置于4 ℃冰箱备用。扩增的产物采用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。

1.4 数据分析

每对SSR引物检测1个位点，每条多态性带为1个等位基因，参照 http://www.Gramene.org/提供的SSR信息进行记录。SSR数据利用POPGENE 32统计软件计算等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Nei’s基因多样性指数(He)和Shannon信息指数(I)[10]。多态性信息指数(PIC)，PIC=1-∑pi2，其中pi为任一引物组合第i对多态性带在所有供试材料中出现的频率。基因杂合度(H)=观察到的杂合数/试验样品总数。DNA图谱中，在同一迁移位置，列出二元数据矩阵：有DNA扩增带的记为“1”，无扩增带的记为“0”，缺失条带记为“2”。使用NTSYS-p 0 c 2.10 e统计分析软件计算品种间的遗传相似系数(genetic similarity，GS)，根据遗传相似系数的相关数据采用UPGMA(非加权配对算数平均法)进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 SSR标记多态性及各位点的PIC值分析

利用分布于水稻12条染色体的56对SSR引物进行遗传相似性和遗传多样性分析。共检测到等位基因148个，品种间不同位点的等位基因数目变幅为2～5个，平均2.642 9个。在检测到的等位基因中，稀有的等位基因(基因频率小于0.05)有16个，占比10.8%；基因频率大于0.95的有4个，占比2.7%。位点RM 207和位点RM 241均检测到5个等位片段，等位基因数在2～4之间的有54对，占参试引物的96.4%(表2)。

由表2可知，各位点的PIC值平均为0.369 4，变幅为0.040 0～0.748 7。引物RM 207和RM 241均检测到5个等位片段，PIC值分别为0.748 7和0.724 6，说明两个位点的等位片段在各品种间分布频率差异均较大。基因杂合度(H)最高的是0.145 0(RM 156)，而RM 113、RM 212、RM 165、RM 109、RM 322、RM 207、RM 218、RM 3、RM 141、RM 125、RM 214、RM 344、RM 223、RM 186、RM 261、RM 471、RM 241、RM 169、RM 598、RM 131、RM 205、RM 209、RM 511的基因杂合度为0(23对)。

表2 56对SSR引物各等位基因频率及H值Table 2 The allele frequencies and H values of 56 SSR primers

分别对每一染色体上SSR位点的总PIC值和等位片段数进行平均(图1)，结果显示第9号染色体的平均PIC值最高，比12条染色体总平均高29.5%，第1、7号和第12号染色体较低，比总平均低36.6%、33.8%和31.1%(图1-A)，表明9号染色体具有丰富的等位基因片段变异；平均等位片段数的比较分析发现，第4、11号染色体上的平均等位片段最多，均比12条染色体总平均多14.3%，第1号和第12号染色体上的最少，分别比12条染色体总平均少12.4%和14.4%(图1-B)，结合平均PIC值，表明第1号和第12号染色体的等位基因片段变异较少或者等位片段分布频率的均匀度较差。

2.2 遗传多样性分析

对147份贵州地方红米品种资源的遗传多样性分析发现贵州地方红米品种的遗传多样性水平较低。由表3可知，有效等位基因数变幅为1.034 6～3.978 8，平均1.758 5个，有效等位基因所占比例为66.5%。Nei’s基因多样性指数变幅为0.033 4～0.748 7，平均为0.354 9；Shannon信息指数平均为0.604 6，变幅为0.086 1～1.471 4，其中最大值位点是引物RM 474，最小值位点是RM 435。Nei’s基因多样性指数是等位基因数和频率的函数[11]，故具有较高基因多样性指数值的SSR标记如RM 474具有较高的检测效率。

表3 147份红米材料遗传多样性SSR分析Table 3 SSR analysis of genetic diversity of 147 red rice varieties

2.3 遗传相似性分析

根据56对SSR引物在147份供试品种中获得的148条扩增带计算供试品种间的遗传相似系数以0.02为组距进行次数分布分析，获得遗传相似系数的次数分布图(图2)。由图2表明，所有供试品种间的遗传相似系数变化范围在0.54～1.00之间，平均为0.728。供试品种的遗传相似系数次数呈正态分布，遗传相似系数在0.64～0.84之间的数量为9 511个，占整个数据的92.3%；0.64以下的有546个，占总数的5.3%；0.84以上的有251个，占总数的2.4%。说明目前贵州省地方红米水稻资源遗传相似性较高，遗传差异较大的品种数量相对较少。

2.4 聚类分析

利用56个SSR标记计算出147份材料的遗传相似系数，在0.54～0.99范围内存在遗传变异。遗传相似性较小的是金华金麻谷和大广麻粘，较大的是油粘红米和青秆粘红米。按UPGMA法进行聚类分析得聚类图(图3)，在遗传相似系数为0.55的水平上，可将供试材料聚为两大类。第Ⅰ类由140份材料组成，占供试材料总数的95.24%。在阈值为0.72处，可将其分为三个亚组，用Ⅰ-1、Ⅰ-2和Ⅰ-3表示，分别含有128、11和1个材料。第Ⅱ类包含7个材料，分别为10号(毫米红)、23号(雷粘)、141号(金华金麻谷)、44号(大红晚谷)、62号(小红晚谷)、48号(大胖谷)及106号(阳猫糯)。根据遗传相似性越大亲缘关系越近的原则，金华金麻谷和大广麻粘亲缘关系相差较大，油粘红米和青秆粘红米亲缘关系较近。在所检测位点中没有基因型完全相同的品种，51号和91号种质名称都为“大红米”，收集地分别为晴隆和安顺，由图3可看出二者遗传背景并不相同。大部分来源地相同的种质没有聚在一起，而不同名的遗传相似性却较高，说明种质之间的遗传差异与收集地没有较大关系。

3 讨 论

遗传多样性是水稻育种与遗传改良的重要基础[12]。国内外学者应用SSR标记对水稻的遗传多样性开展了大量研究[13-23]，马静等[21]对中国宁夏地区的59份水稻主栽品种通过82对SSR引物进行分析，遗传多样性指数平均为0.439 4，强调了宁夏水稻种质多引种于东北和日本是造成遗传多样性不高的主要原因。从夕汉等[22]利用29个SSR标记分析东南亚62个水稻品种，平均多态信息含量为0.515，表明来自同一来源地的品种有狭窄的遗传基础。于萍等[23]采用45对SSR引物对224个太湖流域粳稻地方品种进行遗传多样性分析，平均基因多样性指数为0.197，阐明太湖流域连续多年的选择压力、遗传瓶颈效应是造成遗传基础变小的主要因素。现阶段对于贵州地方红米资源的遗传多样性研究开展较少，马琳等[14]利用13对引物对22份贵阳高坡红米材料进行遗传多样性分析发现，高坡红米品种大多数属于籼稻，且遗传多样性丰富。对比研究结果发现，贵州省现有红米种质遗传多样性较低、遗传基础较狭窄，说明应加强对贵州省现有红米种质的多样性保护。导致出现这种结果的可能原因有：各个地区的红米种质亲缘关系本来就较近，加上农户换种的普遍现象和优良品种的引入，部分遗传多样性较高的地方品种遭到淘汰；其次可能是由于多态性较低的引物也会导致数据分析结果显示贵州省不同地区红米种质的遗传多样性较低。

贵州具有丰富的地方红米水稻资源，多分布于中高海拔山区较寒冷和贫瘠的坡地，具有较强的抗寒性和高山适应性。本研究所用的水稻材料中存在一些品种名称相似的材料，研究发现它们之间的遗传差异较小。从夕汉等[22]对东南亚62个籼稻品种做遗传多样性分析时针对有些品种遗传距离极近的情况提出了可能是由于“同种异名”导致的观点。聚类图中的油粘红米和青秆粘红米具有较高的遗传系数，为0.99，且都来源于安顺，是否为同一种质有待进一步深入研究；大红晚谷与小红晚谷种质名称非常相似，遗传相似系数为0.875，同属于粳稻却来自不同地区；统称为“大红米”的两个种质遗传背景不同。这些现象很有可能都是由于农户换种而引起的“同种异名”与“异种同名”。因而只有尽快收集保护这些种质资源并建立核心种质库，才能避免这样的情况发生，减少水稻遗传基础遗失。

研究结果表明，利用56个SSR标记对147份贵州地方红米材料进行遗传多样性分析，大部分品种间亲缘关系较近，但也有可能是由于所选的标记还不足以区分它们之间的差别。因此，在今后的水稻育种工作中应该增加所用标记位点的数量，增强有利基因的挖掘以及新的种质资源的运用，拓宽贵州红米的遗传基础。与此同时，为了解决我国稻米品质差和粮食安全的问题，需要积极挖掘有利基因及性状，加快收集、保存及利用一些具有遗传基础丰富、农艺性状优良及品质口感较佳的种质资源，培育出优质、适应能力强的品种，尽早实现优质、高产、高效的育种目标。

4 结 论

本研究利用56对SSR引物对贵州省地方红米水稻资源进行遗传多样性分析，平均Nei’s基因多样性指数(He)为0.354 9，平均Shannon信息指数(I)为0.604 6，平均多态性信息含量(PIC)为0.369 4。遗传相似系数平均为0.728，在遗传相似系数为0.55的水平上，可将供试材料聚为两大类，其中第Ⅰ类涵盖的品种有140个，占供试材料总数的95.24%。由此可见，贵州省地方红米水稻资源总体上遗传多样性水平较低，遗传基础较狭窄，应加强种质交流，拓宽贵州地方红米种质遗传基础。