内皮蛋白C受体对类风湿关节炎疾病进展的影响*

刘汇洋，刘轩绮，白静茹，赵京洋，尹芳蕊，王永福

(1.包头医学院第一附属医院，内蒙古 包头 014010；2.包头医学院)

类风湿关节炎(Rhreumatoid Athritis，RA)是一种慢性全身性炎症性自身免疫性疾病，主要特征为滑膜组织内有大量浸润的炎性免疫细胞，并释放细胞因子及趋化因子，导致持续的滑膜炎症，增强软骨细胞分解代谢和破骨细胞生成，最终导致骨侵蚀、骨破坏[1]。目前的研究证实炎症因子包括肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)、白细胞介素-17(Interleukin-17，IL-17)、JAK/STAT途径信号转导通路的细胞因子以及共刺激信号途径(包括APC表面的B7家族分子以及T细胞表面的CD28/CTLA-4分子)等在RA的发病过程中发挥重要作用[2-4]。通过对RA的发病机制研究的积累，人们发现抑制相关炎症因子的表达以及通路激活可以为RA的治疗提供新的思路。在早期研究中，内皮细胞蛋白C受体(Endothelial protein C receptor，EPCR)是内皮细胞的特异性跨膜蛋白，能与蛋白C(Protein C，PC)、活化蛋白C(Activated protein C，APC)，凝血因子VIIa(factor VIIa，FVIIa)等配体结合发挥抗凝及细胞保护作用[5]。EPCR分为膜结合型EPCR(Membrane-bound EPCR，mEPCR)和可溶性EPCR(Soluble EPCR，sEPCR)两种类型，mEPCR表达于内皮细胞表面，与PC特异性结合激活蛋白C发挥抗凝及抗炎作用，mEPCR被炎症因子和凝血酶降解后释放入血，即形成sEPCR[6]。已经有研究指出在RA患者的外周血和滑膜组织中可以检测到sEPCR和mEPCR的异常表达[7-8]；并且在CIA小鼠的体内实验证实，EPCR能够调节Th17细胞的分化，参与RA的疾病进展[8-9]。但目前尚未明确两种类型的EPCR的异常表达是否会影响疾病的发展，以及二者的对疾病影响的差异，因此本文进一步研究了sEPCR与mEPCR在RA疾病进展中的作用。

1 材料与方法

1.1EPCR的结构及表达情况分析 通过Gene Expression Ominibus(GEO)数据库，对人类可溶性EPCR和膜型EPCR的基因结构差异进行分析(NCBI参考序列：NM_006404.5)；使用人类蛋白质图谱(The Human Protein Atlas，https://www.proteinatlas.org/)数据库，分析EPCR在组织和细胞上的表达情况；并通过整理GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，分析RA、骨关节炎(Osteoarthritis，OA)患者和健康个体关节滑膜EPCR的表达差异。来自正常人的10个关节滑膜样本(GSM1332201、GSM1332202、GSM1332203、GSM1332204、GSM1332205、GSM1332206、GSM1332207、GSM1332208、GSM1332209、GSM1332210)，OA患者的10个关节滑膜样本(GSM1332211、GSM1332212、GSM1332213、GSM1332214、GSM1332215、GSM1332216、GSM1332217、GSM1332218、GSM1332219、GSM1332220)，以及RA患者的10个关节滑膜样本(GSM1332221、GSM1332222、GSM1332223、GSM1332224、GSM1332225、GSM1332226、GSM1332227、GSM1332228、GSM1332229、GSM1332230)分析RA、OA以及健康个体滑膜上EPCR的表达差异。

1.2动物及试剂 雄性DBA1小鼠(8周龄)购自南京大学动物模型研究中心。CIA造模成功后将小鼠随机分为5组：空白组(n=5)，CIA组(n=5)，空载体组(n=5)，sEPCR组(n=5)，mEPCR敲减组(n=5)。用于体内实验的EPCR重组蛋白购自Sino Biological(中国北京)，EPCR腺病毒小干扰载体购自上海吉凯基因化学技术有限公司，牛Ⅱ型胶原蛋白(CⅡ)和弗氏完全佐剂(CFA)购自Chondrex(美国华盛顿州雷德蒙德)。

1.3CIA诱导 根据标准方案诱导CIA小鼠。将2 mg/mL的牛Ⅱ型胶原溶于10 mM乙酸中，温和搅拌，终浓度为4 mg/mL，4 ℃过夜，然后用等体积的完全弗氏佐剂乳化(含4 mg/mL结核分枝杆菌)。随后将100 μL乳化的Ⅱ型胶原于DBA1/J小鼠尾根部2 cm处皮内注射。21 d后，重复该过程进行加强免疫建立CIA小鼠模型[10-11]。

1.4EPCR体内干预策略

1.4.1可溶性EPCR的体内干预 为了研究EPCR表达上调是否可以预防或缓解关节炎，在首次免疫后，参考Meilang Xue等人的研究，对CIA小鼠以0.5 mg/kg的剂量每周两次进行腹腔内注射sEPCR重组蛋白[8, 12]，直至加强免疫，构建可溶性EPCR干预模型。

1.4.2EPCR小干扰载体的体内干预 为进一步证实EPCR在RA疾病进展中的作用，小鼠首次免疫后，以1×109PFU/20g的剂量对EPCR敲减组小鼠进行每周一次的腹腔内注射EPCR小干扰载体[13]，下调CIA小鼠EPCR的表达，直至加强免疫。

1.5临床症状评估 加强免疫后第7 d，对CIA小鼠的关节进行连续评分，标准如下：4=从踝关节到整个爪的肿胀和(或)红；3=2个以上的关节肿胀和(或)红；2=累及2个关节的肿胀和(或)红；1=1个脚趾关节的红色斑点或肿胀；0=正常。每只小鼠的关节评分是四肢评分的总和，最高为16分。

1.6组织病理学分析 在第28 d 处死CIA小鼠，并进行组织学和放射学评估。用锥形束扫描仪(SkyScan 1176；高分辨率体内X射线显微断层扫描仪，德国布鲁克生物公司)获得后肢的微型计算机断层扫描平片。之后分离小鼠后肢，并将关节固定在福尔马林中，对标本进行进行石蜡包埋处理，组织切片用苏木素-伊红染色(HE染色)和甲苯胺蓝染色(TB染色)。根据滑膜组织中炎性细胞浸润数量、蛋白多糖损失的程度以及关节软骨破坏、骨侵蚀的程度对关节的组织病理学变化进行评分，评分范围分别为0～3[10, 12]。

2 结果

2.1mEPCR和sEPCR结构差异以及EPCR在细胞、组织上的表达差异 目前的研究证实，金属蛋白酶ADAM17是导致mEPCR脱落产生sEPCR的主要切割酶，通过对GEO数据库的整理发现了两种EPCR的结构差异，经ADAM17剪切，sEPCR较mEPCR缺少了跨膜区(图1A)。EPCR 存在于多种脏器及组织，如肺脏、肾脏、脾、皮肤等(图1B)，同时，本研究发现EPCR广泛表达于各种细胞，如单核细胞、中性粒细胞、平滑肌细胞、T细胞和心肌细胞等(图1C)。此外，通过对GEO数据库中EPCR在RA患者滑膜组织中的表达水平进行整理，结果显示在健康个体、RA患者及OA患者的关节滑膜中存在EPCR的表达差异(图1D)，与健康人群相比，RA及OA患者滑膜中EPCR的表达明显下降。见图1。

图1 mEPCR和sEPCR结构差异以及EPCR在细胞、组织上的表达差异

2.2通过sEPCR干预可以缓解CIA小鼠的临床症状 为了研究可溶性EPCR在RA中的作用，本研究给予CIA小鼠0.5mg/kg的可溶性EPCR进行体内实验。对小鼠关节进行连续评分可以看出，相比对于对照组，sEPCR可溶性蛋白干预后，CIA小鼠的关节评分明显降低(图2A)；没有给予干预措施的CIA小鼠有明显的关节红肿，而给予sEPCR治疗后，小鼠四肢关节仅表现为轻度的红肿(图2B)。在加强免疫后第28 d处死小鼠，并分离后肢，获得micro-CT(图2C)，结果显示空白对照组小鼠关节间隙清晰，边缘光滑，没有明显的骨质破坏，而CIA小鼠关节间隙明显狭窄，并有一定程度的骨侵蚀和关节变形，图2C右侧为给予sEPCR干预的CIA小鼠关节micro-CT，可以看到虽然有一定程度的骨破坏，但相比对照组明显减轻。上述结果表明，sEPCR表达的上调可以减轻炎症反应，保护关节的完整性并防止关节变形，延缓RA的疾病进展。见图2。

图2 sEPCR干预后CIA小鼠的关节评估

2.3mEPCR表达下调加重CIA小鼠的临床症状 为了进一步研究mEPCR对RA疾病进展的影响，给予小鼠注射EPCR空载体作为阴性对照，实验组CIA小鼠腹腔注射EPCR小干扰载体下调CIA小鼠的mEPCR表达，并对小鼠进行关节评分。结果表明，相比空载体干预对照组小鼠，EPCR表达下调后小鼠关节评分显著升高，并且可以看到EPCR表达下调组CIA小鼠相比对照组，四肢关节肿胀明显(图3A-B)。同样，对两组小鼠进行了Micro-CT检查，结果显示(图3C)，EPCR表达下调后，有显著的骨侵蚀和骨破坏，关节间隙狭窄也更为严重。以上结果表明，mEPCR可能对关节有保护作用，其表达下调会加重RA的关节表现，导致RA病情加重。见图3。

图3 mEPCR表达下调CIA小鼠的关节评估

2.4sEPCR干预缓解 CIA小鼠的骨侵蚀 对CIA小鼠的关节进行了HE染色和甲苯胺蓝染色。图4A为小鼠关节的HE染色。左侧为空白对照组，可以看到关节软骨表面光滑整洁，软骨细胞排列整齐，分布均匀，染色均一，软骨下骨染色均匀，与软骨分界清晰；而CIA对照组关节破坏明显，有明显的软骨及骨侵蚀，软骨连续性中断，骨与软骨界限模糊，高倍镜下可见到软骨层变薄，细胞排列紊乱，毁损严重；右侧为sEPCR干预组小鼠的关节，可以看到软骨细胞分布相比CIA对照组小鼠较为均匀，骨和软骨的破坏明显减轻。图4B图为小鼠后肢关节的甲苯胺蓝染色。左侧为空白对照组，可以看到紫蓝色为软骨基质，主要成分为蛋白多糖；中间为CIA组，可以看到关节间隙变窄，软骨染色基质染色较浅，面积减小，蛋白多糖丢失和滑膜浸润明显，软骨和骨侵蚀较重；而给予sEPCR干预后，关节间隙狭窄、骨和软骨破坏得到显著改善，蛋白多糖的丢失较CIA对照组减少。图4C为根据蛋白多聚糖的丢失情况以及关节破坏情况对各组小鼠的后肢关节进行组织学评分。这些结果表明，sEPCR表达上调可以减少炎性细胞的浸润，保护关节的完整性，减少骨和软骨的破坏，控制RA疾病病情的发展。见图4。

图4 给予sEPCR重组蛋白干预后，二次免疫结束后第28 d的结果

2.5EPCR小干扰载体的干预加重CIA小鼠的骨破坏 给予CIA小鼠EPCR小干扰载体干预后，对小鼠关节进行组织学评估。图5A为小鼠后肢关节的HE染色，结果显示，相比阴性对照组以及给予空载体干预的CIA小鼠，给予EPCR小干扰载体后，关节软骨层完整性被破坏，软骨细胞分布不均，软骨下骨侵蚀加重，关节间隙狭窄明显。对关节进行甲苯胺蓝染色结果显示，EPCR敲减组小鼠关节的软骨及骨破坏较对照组小鼠更为严重，软骨基质染色面积减小，蛋白多糖丢失增加(图5B)。图5C为对关节的组织病理学评分。综上，给予EPCR小干扰载体干预后，mEPCR表达降低而导致CIA小鼠表现为明显的关节炎症，包括炎症细胞浸润和蛋白多聚糖丢失增加以及更为严重的骨和软骨侵蚀，也就是说，mEPCR表达下调能够介导RA疾病加重。见图5。

3 讨论

mEPCR主要表达于细胞内皮表面，可以与PC结合，进一步活化PC，发挥抗凝及细胞保护作用；EPCR释放入血后，形成sEPCR，可以结合PC抑制APC的产生，或与APC结合阻断APC的细胞保护功能[14]。在以内皮细胞功能障碍为特点的自身免疫性疾病中可检测到sEPCR的水平升高，在系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus，SLE)患者的外周血中可检测到sEPCR水平明显增加，尤其以累及肾脏的患者为著，可以作为血管损伤的标志物[15]。Faioni, E等人[16-17]的研究显示在炎症性肠病患者中，sEPCR的水平明显增高，但在疾病静止期与活动期sEPCR的水平没有明显差异，相反，mEPCR的水平是降低的，这使得PC通路受阻，APC活化减少，炎症加重。本文通过对GEO数据库的整理发现，在RA患者的滑膜组织中也存在EPCR的异常表达，其表达水平显著低于健康对照组，因此我们提出EPCR的表达下调能否介导RA疾病进展。我们的实验通过给予小鼠腹腔内注射EPCR敲减载体，使CIA小鼠mEPCR表达水平下调，发现小鼠四肢关节红肿程度加重，进一步的组织病理学分析同样验证了上述观点。

此外，EPCR可以介导APC通过抑制单核细胞的迁移以及NF-κB信号转导和TNF-α等促炎因子产生[7, 18-19]。NF-κB是RA滑膜细胞中诱导炎症介质的一个重要的细胞内信号通路，[20-21]因此抑制NF-κB的激活和炎症因子的释放，可以有效控制炎症；EPCR还能够通过调节Th17细胞的分化[8, 22]，发挥抑炎作用，减少骨和软骨的破坏，因此EPCR水平的升高可能会对RA的异常免疫和炎症起到保护作用。我们推测RA患者表现的炎症反应可能与EPCR表达降低有关。Meilang Xue等人的研究指出[7]，在给予CIA小鼠EPCR或APC处理后，观察到小鼠的关节症状可以得到明显的改善。我们通过给予CIA小鼠体内注射sEPCR重组蛋白上调小鼠sEPCR的表达，观察到小鼠关节炎症状得到了一定程度的控制，骨破坏和骨侵蚀相应减轻。

有研究指出，T细胞表面的EPCR可与免疫共分子协同表达，如PD-1/CTLA-4及ICOS等。抑制炎症的新型生物制剂阿巴西普(abatacept，CTLA-4Ig融合蛋白)是一种共刺激抑制剂，与其他的生物制剂相比较，它可以在炎症级联反应的上游发挥作用。研究指出共刺激抑制剂可以与APC表面的B7分子结合，干扰B7-CD28协同共刺激途径，从而阻断T细胞活化，控制RA炎症并改善关节破坏[23-25]。进一步的研究显示sEPCR能够抑制Th17细胞分化，并影响Th17/Treg细胞的比例，这一过程能够参与RA的疾病进展。

综上所述，可溶性和膜型EPCR的异常表达对RA的疾病进展具有重要作用，其中sEPCR的表达上调可以减慢疾病进展；相反，mEPCR表达下调会加重RA病情。这一现象提示，EPCR具有作为一种新型的RA的治疗干预靶点的应用潜力。