猪NR4A1基因的多态性与产仔数性状的关联分析

刘林清，李庆岗，苏世广，周 梅，张 威，王重龙

（安徽省农业科学院畜牧兽医研究所，猪分子数量遗传学安徽省农业科学院重点实验室，畜禽产品安全工程安徽省重点实验室，安徽 合肥 230031）

NR4A1基因作为一个孤核受体的转录因子，编码类固醇-甲状腺激素超家族，是一类配体依赖转录调节蛋白[1]。有研究者指出，在卵巢粒层细胞中发现，当抑制卵巢特异的芳香化酶PII启动子时，NR4A1基因可以抑制芳香化酶CYP19A1基因的表达[2]，并且在小鼠的黄体期检测到NR4A1基因可以提高类固醇生成基因如20α-羟基类固醇脱氢酶在黄体中的转录活性[3]。NR4A1基因广泛地在卵巢[4]、黄体[5]、大脑、肾上腺、肌肉和性腺中表达。此外还有研究者利用原位杂交方法分析认为，在注射促黄体激素（LH）/人绒毛膜促性腺激素（HCG）可诱导基因在卵巢排卵前卵泡颗粒层细胞中快速短暂的表达[6-7]。这些研究结果进一步暗示了NR4A1基因在卵巢卵泡发育及排卵过程后都发挥着作用。

为此，本研究建立了NR4A1基因的PCR-DdeIRFLP分型技术，并在3个中外猪种中进行多态性分型，还在长白猪猪群中检测该位点的多态性并与产仔数性状进行关联分析，以期为提高猪产仔数提供一个有用的分子标记。

1 材料与方法

1.1 试验动物及组织采集

试验地点在安徽省科鑫养猪育种有限公司；试验动物：于2014年7月采集58头淮猪、75头长白猪及85头淮猪新品系Ⅱ系猪的耳组织放置于75%酒精的离心管中，-20 ℃保存备用；饲养管理条件和饲粮营养水平一致。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采用苯酚-氯仿抽提法，TE溶解，-20 ℃冷冻保存。

1.2.2 引物的设计与合成 根据NR4A1基因DNA序列，应用Premier 5.0软件在多态位点（第5内含子）两侧，设计一对引物，突变位点可用限制性内切酶DdeI识别，引物由上海生工生物公司合成。引物信息如下：NR4A1基因的上游引物：5'-TTCCTCTGGGTCACAACG-3'，下游引物：5'-CTCACAGAGTCAATGCCG-3'，片段长度为128 bp，退火温度为63.1 ℃。

1.2.3 PCR扩增 PCR反应体系为25 µL，其中PCR 2×Taqmix 12.5 µL，10 mmol/µL的引物各0.5 µL，DNA模板1 µL（DNA约100 ng），加ddH2O至25 µL。PCR反应条件为第1步95 ℃变性5 min；第2步95 ℃变性45 s；第3步62.5 ℃复性40 s；第4步72 ℃延伸35 s；重复第2至第4步35个循环，之后再72 ℃延伸10 min，最后降温至4 ℃保存。PCR扩增产物用浓度为1.5%的琼脂糖凝胶电泳，核酸染料染色，凝胶成像系统中观察，可见到片段大小为128 bp的清晰条带。

1.2.4 限制性内切酶酶切（RFLP）NR4A1基因的PCR产物用DdeI内切酶酶切，反应体系为：10×Buffer 1 µL，DdeI酶0.30 µL（10 U/µL），加PCR产物至10 µL；37 ℃反应8～12 h；然后，酶切产物在2%琼脂糖凝胶中电泳，核酸染料染色，凝胶成像系统中观察。

1.3 数据处理分析

1.3.1 统计分析的软件 采用SAS 8.0统计软件（SAS Institute Inc, Version 8 Edition）的GLM程序进行标记方差分析，并进行显著性检验。

1.3.2 基因效应统计分析模型 依据Liu等[8]所述方法建立的单标记回归统计模型，除了猪个体为随机效应以外，其他因素均为固定效应。所采用模型如下：Y=平均值+基因型+胎次效应+残差，其中Y为性状表型值。

2 结果与分析

2.1 猪NR4A1基因的多态位点检测

PCR扩增片段长度为128 bp，经DdeI酶切后产生3种基因型（图1）。当多态位点为GG基因型时，则造成了DdeI酶切位点，PCR产物经DdeI消化后产生2个片段（96 bp+32 bp），记为等位基因G；当多态位点为AA基因型时，则酶切位点消失，PCR产物经DdeI消化后产生1个片段（128 bp），记作等位基因A。

图1 猪NR4A1基因DdeI酶切分型结果

2.2 猪NR4A1基因在不同猪群体中基因型和等位基因的频率分布

由表1可见，NR4A1基因DdeI酶切位点在所检测的3个猪群中，均发现G等位基因占优势。

表1 NR4A1基因PCR-DdeI-RFLP基因型频率和等位基因频率分布

2.3 猪NR4A1基因DdeI多态位点基因型与猪产仔数性状的关联分析

应用基因效应统计分析模型，采用SAS统计软件的GLM程序分别在长白猪群体中进行猪NR4A1基因PCR-DdeI-RFLP多态位点与产仔数性状的关联分析。

在长白猪群体中，所有胎次产仔数均呈现GG>AG>AA的趋势。其中，GG型个体和AG型个体的所有胎次产仔数分别显著高于AA型个体（P<0.05），详见表2。统计结果显示，GG型母猪具有较高的产仔数，G等位基因为优势等位基因。

表2 NR4A1基因PCR-DdeI-RFLP基因型与长白猪产仔数性状的统计分析

3 讨论

淮猪是我国地方猪种，具有生长速度慢、繁殖力高等特性。长白猪是引进的外来猪种，其具有生长速度快、繁殖力不高等特性。而淮猪新品系Ⅱ是以安徽省优良地方品种淮猪为母本，以国外优质瘦肉型品种长白猪、大白猪为父本，经过杂交育种组建基础群，然后运用标记辅助选择BLUP估计育种值进行群体继代选育的。NR4A1基因作为一个孤核受体的转录因子，编码类固醇-甲状腺激素超家族。笔者前期采用RT-PCR方法分析猪NR4A1基因在用PMSG（孕马血清促性腺激素）和HCG（人绒毛膜促性腺激素）处理卵巢颗粒细胞不同时间后的表达情况，研究结果表明，NR4A1基因在卵泡颗粒细胞生长、发育等过程中瞬时表达[9]，这与其他研究者的结果是一致的[6-7]。这些研究结果进一步证实NR4A1基因在卵巢卵泡发育及排卵过程后都发挥着作用。所以，我们选择NR4A1基因作为研究猪产仔数性状的候选基因。

本研究发现，NR4A1基因DdeI酶切位点在所检测的3个猪群中均发现G等位基因占优势，并且在长白猪猪群体中，所有胎次产仔数均呈现GG>AG>AA的趋势。其中，GG型个体和AG型个体的所有胎次产仔数分别显著高于AA型个体（P<0.05），从以上结果表明，GG型母猪具有较高的产仔数，G等位基因为优势等位基因。因此选择GG型个体留种可提高群体的产仔数，在今后选育中可适当提高等位基因G的频率。