肉及肉制品中动物源性成分常见检测方法研究进展

燕 妮,孙世琨

（甘肃省食品检验研究院，甘肃 兰州 730300）

随着人民生活水平的提高，消费者对肉及肉制品的需求逐年增加，普通的产品已经不能满足广大消费者的需求，此时一些优质高蛋白的肉类产品、加工肉制品脱颖而出，因其营养价值高、种类多、食用方便而深受广大消费者喜爱。肉及肉制品可以提供人类维持生命活动所必需的氨基酸、多种维生素（如维生素B6、B12、维生素D 等）、多种微量元素（铁、锌和硒等）以及大量的不饱和脂肪酸[1]。在利益的驱使下，一些不法商家为了牟利将低价肉（鸡、鸭等）掺入或冒充高价肉（牛、羊等），市场上肉类掺假现象屡禁不止[2]。目前已经研发了多种检测方法来鉴别肉类掺假现象，其准确性和高效性逐渐提升，但仍有欠缺，如无法高通量快速检测等问题。

肉及肉制品中动物源性成分的鉴定方法很多，如近红外光谱法、酶联免疫法、聚合酶链式反应等。自PCR 技术被广泛应用于肉及肉制品中动物源性成分的测定以来，基于DNA 的PCR 分析技术也在不断发展，如环介导等温扩增技术、AFLP (扩增片段长度多态性)标记法、PCR-RFLP（限制性片段长度多态性）技术、实时荧光PCR 技术、基因芯片技术和DNA 条形码技术等。本文综合论述了目前肉及肉制品中动物源性成分的检测技术，并对有应用前景的新技术做了简要阐述。

1 理化检测方法

理化检测方法主要是利用样品的光学特性、化学组成等特点检测不同动物品种的肉类组分。常见的方法有近红外光谱法、高效液相色谱 法等。

1.1 近红外光谱法

近红外光谱法主要利用样品的光学特性，通过光在样品中吸收、反射、散射等特点构建待测样品的特征光谱进而区分样品种类，是一种快速有效的检测方法[3]。赵红波等以近红外光谱分析技术结合模式判别方法，建立了一种准确、快速鉴别猪肉和牛肉的方法[4]。周娇娇等利用近红外光谱分技术结合化学计量学方法建立了SVM 模型，可以快速鉴别7 种淡水鱼品种[5]。白京等应用近红外漫反射光谱分析技术结合化学计量学方法对羊肉卷中猪肉掺假比例的定量检测研究，将不同样品的光谱数据进行建模分析，实现了羊肉卷中猪肉掺假比例的定量检测[6]。近红外光谱法操作简单，快捷、样品用量少且无损样品等优点，目前已成功地应用在食品、农业、医药等领域。

1.2 色谱质谱联用技术

色谱质谱联用技术是通过高分辨质谱技术寻找不同物种的特异性多肽，再利用高效液相色谱-串联质谱进行定性及定量，该技术因灵敏度高、样品前处理简单、可以避免出现假阳性样品、可同时测定多个物种而广泛应用在食品检测中。

Kim 等凝胶电泳结合高效液相质谱联用技术，寻找四种主要肉类物种的区别标记。利用一维凝胶电泳法分别对各类肉质的肌原纤维蛋白和肌浆蛋白进行分析，然后通过高效液相质谱联用进行分析，证实可以利用肌钙蛋白（TnI）、烯醇化酶、乳酸脱氢酶（LDH）和三磷酸异构酶（TPI）的电泳迁移率不同，可作为不同肉制品区分的标志[7]。Magdalena Montowska等利用双向电泳技术对目标的六种动物的一部分蛋白质进行分析，发现一类蛋白质在肉类老化变质和加工完成的过程中含量相对稳定，然后通过质谱对这类蛋白质进行定性分析。研究发现以调节蛋白、代谢酶、一些肌原纤维蛋白和血浆蛋白的特定物种的电泳迁移率差异为特征，可以区分肉质的种类[8]。电泳和质谱结合被广泛运用于鉴别领域，但是存在无法进行高通量分析的缺点。

Sarah 等采用LC-QTOF-MS 方法对冷冻、蒸煮猪肉的胰蛋白酶进行标记，建立MRM 方法进行验证。发现多反应监测（MRM）能检测到四种肽，这四种肽在猪肉样本中始终存在，可以作为从热加工肉品中鉴定区分出猪肉与牛肉和其他肉类的被标记物[9]。这研究体现了蛋白组学方法的特异性和选择性的优点。古淑青等采用超高效液相色谱-高分辨质谱（HPLC-QE）和超高效液相色谱-三重四极杆质谱（HPLC-MS/MS）相结合的方法进行特征肽段的检测，再通过比对分析筛选出4 种肉类的20 个特征性多肽段，进行验证和多反应监测（MRM）定量研究，建立了羊肉掺假鉴别的定量测定方法[10]。张颖颖等首先采用高分辨质谱仪（nLC-QE）分别找出牛肉、猪肉和鸡肉的相对专属性多肽链，进一步利用液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）的多反应监测模式（MRM）对掺杂猪肉或鸡肉的牛肉进行检测，可以快速进行鉴别并准确定量分析[11]。李莹莹等利用蛋白组学的方法研究了5 种常见的食用肉中相对种属特征性多肽，采用LC-MS/MS 技术对羊肉和鸭肉混合物种特征性的多肽进行了验证和定量分析，可准确的区分不同的肉种类[12]。Sentandreu 等通过液相色谱-串联质谱检测样品物种特异性肽段或氨基酸，建立了一种检测肉制品中是否掺入鸡肉成分的方法[13]。金绍明等应用非标记蛋白准确定量的方法，通过四极杆串联飞行时间高分辨质谱分析每种肉类样品的特异性肽段，进而准确分析掺假肉类的种类[14]。色谱和质谱是基于动物肌肉蛋白的特征性肽段来鉴别肉类品种的，而蛋白质在加工过程中容易发生变性从而增加检测难度。

2 以免疫学为基础的检测方法

常见的以免疫学为基础的检测方法有基于抗原-抗体特异性识别的酶联免疫法、胶体金免疫层析法等方法，具有快速、简便、特异性好、灵敏度高和低成本的特性。肉类掺假常见的检测方法是ELISA 技术的间接法和双抗体夹心法，其原理是通过对样品中的特异性抗原进行定性或定量识别从而鉴别不同物种的肉类[15-16]。

Liu 等建立了以单克隆抗体为基础的酶联免疫吸附试验，该方法使用一对可以特异性识别骨骼肌肌钙蛋白I (TnI)的单克隆抗体(MAbs 8F10 和5H9)对样品进行检测，可以测定生鲜肉、加工肉以及饲料中猪肉成分的含量，为检测肉制品和饲料制品中微量猪肌肉组织的污染提供了一种快速、可靠的方法，保证了产品的质量和安全[17]。Rittenbur 等建立了一种间接酶联免疫吸附法，该方法可以快速、灵敏地测定肉制品中大豆蛋白的含量[18]。免疫技术操作简便、灵敏性高，但对没有特异性抗体的样品不能进行分析，且品种接近的蛋白之间可能会发生交叉反应，掩盖品种特异性的条带，因此可能会产生假阳性结果[19]。

3 分子生物学检测方法

与基于蛋白质的方法相比，基于DNA 的检测方法通常被认为更灵敏、可靠，因为DNA 在高温下相对稳定，并且存在于大多数细胞中，而大多数蛋白质在加工过程中失去了它们的生物活性[20-21]。近年来，以分子生物学为基础的检验方法高速发展起来，各种动物源性成分的检验检测技术相继涌现，如聚合酶链式反应技术、实时荧光定量PCR 技术、多重PCR 技术、核酸印迹法、环介导等温扩增技术、限制性片段长度多态性聚合酶链式反应、基于分子杂交的基因芯片技术、微滴数字PCR 方法和DNA条形码技术[22]。

3.1 实时荧光定量PCR 技术

现行的动物源性成分检验标准中，较为多见的是实时荧光定量PCR 方法，该技术在扩增体系中引入荧光集团，通过荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析，该方法与传统PCR 方法相比更加灵敏、准确以及便捷[24]。赵新等以线粒体中细胞色素b 的DNA 序列为目的基因，通过标准曲线的建立、反应方法优化等建立了肉制品中羊源性成分的实时荧光PCR鉴别方法[25]。Xu 等建立了一种多重TaqMan 实时核酸聚合酶链反应检测方法，可同时检测鸭肉、猪肉、牛肉和鸡肉四种源性成分[26]。

3.2 微滴数字PCR 技术

微滴数字PCR 技术是一种新兴的核酸定量检测方法，通过微滴生成仪把反应体系均分到大量反应单元中独立地进行PCR，并根据泊松分布和阳性比例来计算DNA 初始浓度，与传统PCR、定量PCR相比，其结果的精确度、准确性和灵敏度更佳[27]。

李伟琦等建立了一种适用于微滴式数字PCR(ddPCR)和芯片式数字PCR(cdPCR)平台的火鸡成分定性定量检测方法，探索了火鸡肉质量与DNA 浓度、DNA 浓度与拷贝数浓度之间的关系，且分别确定了ddPCR 与cdPCR 平台的检测限[28]。史艳宇等建立了一种肉制品中鸭源性成分的微滴数字PCR 检测方法，可以有效测定鸭源性成分且抗干扰性强，灵敏度高[29]。Cai 等以微滴式数字PCR 技术为基础，研究发现生肉重量与DNA 重量、DNA 重量与DNA拷贝数都呈线性关系，建立了基于DNA 拷贝数计算生肉重量的公式，从而对肉制品中猪肉和鸡肉进行准确定量[30]。王珊等通过微滴式数字PCR 方法对样品中的羊源性和猪源性成分的含量比例进行了准确定量，该方法对判断样品中其他种类的动物源性成分是故意添加还是无意沾染提供了技术支持[31]。Wang 等应用微滴式数字PCR 技术建立了肉制品中山羊和绵羊的检测方法，并确定了检出限和定量限分别为1 和5 copies/μL，通过用已知比例的混合样品和市售产品验证了该方法的准确性，结果表明ddPCR 方法在山羊和绵羊源性定性及定量检测方面具有较高的精确性和实用性[32]。微滴式数字PCR技术能对模板浓度进行精准定量，但其成本较高，难以大面积推广应用。

3.3 基因条形码技术

基因条形码技术指用某物种特异性的小片段DNA 序列来代表该物种，就像超市利用条形码扫描区分不同的商品一样，通过分析这段DNA 序列从而实现快速、准确和自动化的物种鉴别。因动物线粒体细胞色素C 氧化酶亚基基因具有物种特异性的单核苷酸位点，且在深加工的肉制品中保存较为完整，故通常选择其作为条形码基因。邱德义等提取了16 份鱼类及其制品的基因组DNA，利用动物细胞色素C 氧化酶I（COI）基因的通用引物进行PCR 扩增，扩增产物测序后，通过Genbank 数据库、DNA 条形码数据库对其序列进行比对分析鉴定，快速鉴别鱼肉等水产制品的动物源性成分[33]。李新光运用DNA 条形码技术、PCR-RFLP 和荧光定量PCR 等技术建立了常见鱼类成分鉴别技术体系，为鱼肉及其制品的真伪鉴别提供技术支持[34]。王爽等以牛、羊、猪、鸭4 种动物的基因组DNA 为模板，以COI 基因为靶基因序列，通过13 对引物进行PCR扩增、测序从中筛选出最优序列，从而建立了4 种动物源性食品的DNA 条形码鉴别技术[35]。Hellberg等通过对60 种肉类和家禽产品的细胞色素C 氧化酶亚基I(COI)基因进行全长条形码(658bp)和迷你条形码(127bp)编码，将得到的序列与生物条码数据库(BOLD)和基因库进行比对，结果发现全条形码的测序成功率(68.3%) 高于微型条形码的测序成功率(38.3%)，为深加工肉类产品的动物源性检测提供技术参考[36]。虽然DNA 条形码技术操作简单，但也存在一定的局限性，如DNA 条形码数据库亟待完善、不太适用于多组分肉类制品的检测等。

近年来，肉类掺假事件屡有报道，相应的可追溯性问题越来越受到重视，因此，开发高效、快速、低成本的检测方法来识别肉类样品中的动物源性成分来源迫在眉睫。