白癜风动物模型研究进展

黄新绿 杜 娟 徐前喜 王 芳 李 曼 张艳坤 丁晓岚

北京大学人民医院皮肤科，北京，100044

白癜风(vitiligo)是获得性色素脱失性皮肤病，以表皮黑素细胞缺失而出现皮肤和黏膜白斑为特征。白癜风的病因和发病机制尚未被完全阐明，是该领域的研究重点和难点。目前公认本病是在遗传、自身免疫、氧化应激和环境等多种因素共同作用下导致黑素细胞破坏所致。

动物模型是研究疾病发病机制和开发新治疗的可靠工具。由于白癜风是多因性疾病，现有的动物模型均不能完全模拟白癜风发病的所有机制，而是各有侧重和优势。白癜风动物模型主要包括自发性模型和诱导性模型。自发性白癜风模型包括辛克莱猪、Smyth line鸡和mivit/mivit鼠系等[1,2]。诱导性白癜风模型以小鼠模型为主，主要通过诱导黑素细胞氧化损伤、注射黑素细胞特异性抗原诱导内源性免疫细胞、注射外源性T细胞以及转基因等方法建立(表1)。这些诱导方法模拟了白癜风发病过程中的不同环节，更接近人类白癜风的发病机制。近年来在诱导性白癜风模型的基础上也发现了一些新的治疗靶点。本文综述了常用的诱导性白癜风动物模型及相关进展。

1 黑素细胞应激诱导的白癜风模型

黑素细胞氧化损伤是白癜风发病的重要机制之一。近年来有研究证实，氧化应激和自身免疫存在联系，黑素细胞应激可以激活体内免疫反应，导致黑素细胞损伤。国内很早就有采用化学脱色法制备白癜风动物模型的报道。使用强氧化剂过氧化氢外用于豚鼠皮肤，导致黑素细胞氧化损伤而出现白斑[3]。氢醌也是常见的化学脱色剂，它在酪氨酸酶的作用下被氧化，生成有毒性的半醌基物质，后者使细胞膜发生脂质过氧化，导致黑素细胞破坏[4]。

近年来，有学者报道使用莫诺苯宗(Monobenzone)诱导的白癜风模型。莫诺苯宗化学名 4-苄氧基苯酚[4-(Benzyloxy)phenol]，是一种酚类化合物，目前用于白癜风的脱色治疗。Zhu等[5]将40%的莫诺本宗乳膏局部外用于C57BL/6小鼠皮肤50天后，观察到小鼠用药部位出现白斑。在持续用药后，小鼠非用药部位包括躯干、耳朵和(或)尾巴也出现了白斑，且白斑范围随着用药时间的延长而扩大，最终可能覆盖绝大部分皮肤。由此推测莫诺本宗既有局部毒性作用，又可引发系统性的免疫反应。皮肤活检发现，莫诺本宗可减少局部黑素细胞，并诱导CD8+T细胞增多，这与人类白癜风发病过程相似。Mansourpour等[6]也报道了40%莫诺本宗外用，6周可以成功诱导小鼠白癜风模型。关于莫诺本宗引发白癜风的机制，目前文献报道主要有以下几个方面：首先，莫诺本宗结构与酪氨酸酶相似，可以竞争性抑制酪氨酸酶的活性，抑制黑素的合成；莫诺本宗可诱发氧化应激反应并释放包含黑素体蛋白的外泌体(Exosomes)和热休克蛋白70(heat shock protein 70, HSP70)，进而活化树突状细胞，引发非特异性免疫反应，导致黑素细胞破坏[7]；还有研究发现莫诺本宗能导致黑素细胞内质网未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)，引起白介素6(interleukin 6, IL-6)和IL-8水平增加，随后激活自然杀伤细胞(natural killer cells, NK Cells)，导致黑素细胞损伤[8]。本模型在发病机制和组织学上与人类白癜风非常相似，可用于研究白癜风氧化应激及其与自身免疫之间的联系。

表1 主要诱导性白癜风动物模型

2 免疫诱导的白癜风模型

在黑素瘤的治疗中，很多患者会出现皮肤色素脱失。这是由于机体免疫细胞在对黑素瘤细胞发动“免疫攻击”时，也会识别具有相同抗原的黑素细胞，造成黑素细胞损伤，从而出现皮肤白斑[9]。在对黑素瘤的免疫反应研究中，研究者构建了表达多种黑素细胞特异性抗原的重组牛痘病毒(recombinant Vaccinia Viruses, rVV)。Overwijk等[10]使用表达人酪氨酸酶相关蛋白-1(tyrosinase-related proteins-1，TRP-1)的rVV免疫C57BL/6小鼠，发现注射后80%的小鼠发生毛发变白，且色素脱失与人类黑色素瘤患者使用白介素12(interleukin 12, IL-12)化疗后出现的白癜风相似。这一模型与黑素细胞特异性抗体的产生有关，主要依赖CD4+T细胞。还有学者发现，给小鼠注射抗TRP-1的特异性抗体具有抗肿瘤效果，并会出现色素缺失[11]。Steitz等[12]利用基因枪技术将表达TRP-2的质粒直接导入小鼠皮肤。导入后小鼠皮肤细胞表达TRP-2，且生长的毛发发生色素脱失。另外，注射抗TRP-2抗体也可在小鼠诱导色素脱失。基于这一模型，研究者还利用基因枪技术将表达TRP-2和诱导型热休克蛋白70(inducible heat shock protein 70, HSP70i)的质粒共同导入小鼠皮肤，出现了色素脱失，而HSP70i敲除的小鼠未出现色素脱失，结构改变的HSP70i在该模型中也不能诱导色素脱失，说明HSP70i对于色素脱失具有重要作用[13]。免疫诱导的白癜风模型可以研究宿主内源性的免疫细胞在色素脱失过程中发挥的作用，有助于发现体内导致黑素细胞破坏的免疫因子。这类动物模型还可用于白癜风和黑素细胞肿瘤发病机制和治疗以及二者相关性的研究。

3 转基因动物模型

TCR是T细胞表面的特异性受体，负责识别由主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)所呈递的抗原[14]。TCR转基因动物模型可以体现T细胞介导的自身免疫过程，目前主要有FH小鼠，h3T-A2小鼠和Vitesse小鼠模型以及斑马鱼Nicastrin转基因模型。

3.1 FH小鼠模型 AAD+转基因小鼠表达I型MHC分子，其上有人类HLA-A*021的结合位点，并具有酪氨酸酶Tyr369表型。将AAD+小鼠与缺乏酪氨酸酶的白化病小鼠杂交，从这些小鼠中分离出能特异性识别Tyr369的T细胞克隆。利用这些小鼠的TCR基因可以构建一种TCR转基因小鼠-FH小鼠，FH小鼠的CD8+T细胞能特异性识别Tyr369。将FH小鼠与AAD+小鼠杂交的后代可以出现毛发及皮肤色素脱失，且免疫组化显示白斑处有CD8+和CD4+T细胞浸润。进一步研究发现，这一TCR转基因小鼠模型白斑的发生依赖IFN-γ和T细胞受体CXCR3 (C-X-C motif chemokine receptor 3)，CCR5 (C-C chemokine receptor 5)，CXCR3和CCR5通过与相应的趋化因子CXCL9，CXCL10 ( C-X-C motif chemokine ligand 9、10)和CCL5 (C-C motif chemokine ligand 5)结合发挥作用。该小鼠模型在幼年时出现双侧头面部色素脱失，在生长过程中或成年时才出现躯干色素脱失，而且主要依赖CD8+T细胞，很适合研究细胞因子及相关免疫通路在白癜风中的作用机制[15]。

3.2 h3T-A2 小鼠模型 在黑素瘤的免疫治疗中，具有高亲和力T细胞受体(T cell receptor, TCR)的T细胞可以对肿瘤细胞产生免疫反应，促进肿瘤的消退。Mehrotra等[16]从黑色素瘤患者的肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocytes，TIL) 中分离出人类白细胞抗原A2(HLA-A2)限制性CD4+T细胞，从中分离出高亲和力TCR，然后从HLA-A2+人酪氨酸酶368-376特异性CD4+T细胞系TIL1383I中分离出基因组DNA，以此构建了一个C57BL/6背景的转基因小鼠：h3T-A2小鼠。这种HLA-A2+/酪氨酸酶双转基因小鼠可以早期自发出现毛发色素脱失，且色素脱失随着年龄的增加而加重。作者认为该模型的色素脱失是由于表达TIL 1381I TCR的T细胞对黑素细胞的免疫反应所致。该团队还分别将h3T-A2 小鼠的IFN-γ、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和穿孔素(perforin)基因敲除，发现h3T-A2-IFN-γ-/-组的小鼠色素脱失过程明显受损，而另两组小鼠则没有受损，说明IFN-γ在白癜风发生中具有重要作用。另外，h3T-A2-IFN-γ-/-小鼠比未敲除IFN-γ的小鼠的调节性T细胞(regulatory cells，Tregs)更多，可用于研究Tregs在白癜风发病机制中的作用[17]。

3.3 Vitesse小鼠模型 在h3T-A2小鼠模型的基础上，Eby等[18]先通过设计角蛋白14启动子(keratin 14-promoter)，得到干细胞因子(stem cell factor，SCF)转基因 (K14-SCF)小鼠，再将K14-SCF小鼠与h3T-A2小鼠杂交，获得Vitesse小鼠。Vitesse小鼠可自发出现皮肤色素脱失，并伴有对称性的边界清楚的毛发变白。另外，该小鼠皮损处的T细胞的白介素-17(IL-17)的表达明显增加，而Tregs则明显减少，这与人类白癜风也很相似。但Vitesse小鼠随着时间的推移逐渐出现复色，且在其他SCF转基因小鼠模型中也观察到了复色情况，提示SCF在复色中起作用。Vitesse小鼠具有局部皮肤色素脱失和自发脱色的特征，很适合用于外用药治疗效果的观察。

3.4 斑马鱼转基因模型 除了小鼠之外，斑马鱼与人类的基因具有高度同源性，作为一种新型实验动物，具有便于实验操作，世代短，性价比高的特点[19]。Nicastrin是γ-分泌酶(γ-secretase)的四个亚基之一，Nicastrin的缺陷会影响γ-分泌酶的功能和稳定性。Hsu等[20]研究发现，斑马鱼nicastrinhi1384基因的插入性突变降低了γ-分泌酶的活性，并破坏黑素小体(melanosome)，此突变还会招募吞噬细胞(phagocyte)来吞噬黑素细胞碎片，导致皮肤色素脱失。作者认为，招募吞噬细胞说明Nicastrin参与了皮肤炎症过程，斑马鱼nicastrinhi1384 基因的插入性突变可能成为皮肤色素脱失性疾病和皮肤炎症相关性疾病的良好动物模型。

4 外源性T细胞诱导的白癜风模型

白癜风的自身免疫学机制中，T淋巴细胞介导的细胞免疫发挥了主要作用。移植不同TCR转基因小鼠的T细胞，来诱导宿主发生针对黑素细胞的免疫反应，可以诱导白癜风。

Harris等[21]利用一种变异形式的Kit配体在C57BL/6小鼠的基础上诱导出KRT14-Kitl*4XTG2Bjl 小鼠(简称KRT14小鼠)，KRT14小鼠不仅毛发呈黑色，其表皮也呈黑色，因而更接近人类的皮肤。他们又将表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的DPEGEP小鼠与表达前黑素小体蛋白(premelanosome protein, PMEL)的TCR转基因小鼠杂交，得到GFP-PMEL TCR转基因小鼠(简称PMEL小鼠)。PMEL小鼠的T细胞表达黑素细胞特异性抗原PMEL的受体，因此可以特异性识别黑素细胞来发挥免疫效应。Harris等从PMEL小鼠的脾脏中分离出GFP-PMEL CD8+T细胞，然后将其静脉注射入经过亚致死剂量辐射后的KRT14小鼠体内，这些GFP-PMEL CD8+T细胞通过特异性杀伤作用破坏黑素细胞。注射后5～7周，KRT14小鼠出现皮肤色素脱失，色素脱失多发生在耳朵、鼻子、掌跖和尾巴部位，皮肤的色素脱失可更好地模拟人类白癜风的发病过程。另外，通过该模型，他们还发现在色素脱失区域的皮肤γ-干扰素(Interferon-γ, IFN-γ)表达增加，阻断IFN-γ及其下游JAK-STAT(Janus kinase-signal transducers and activators of transcription)通路可以减少皮肤中CTLs的数量并阻碍色素脱失过程，提示阻断IFN-γ相关通路可能成为白癜风治疗的新方法。随后，在Harris鼠模型基础上进行的JAK激酶抑制剂治疗白癜风的动物实验取得良好的疗效[22]，目前JAK抑制剂已经开始人体的临床试验[23]。

5 结语

白癜风是一种多因素作用、病因复杂的疾病。适合的、有代表性的动物模型在白癜风发病机制研究和开发新疗法中发挥关键作用。诱导性白癜风动物模型可以模拟白癜风发病的不同机制，且动物廉价易得，但应注意因为种属不同，动物模型还是与人类的发病过程有所差异。不同模型具有各自的特点，在实际研究中应根据研究目的选择合适的动物模型。