清香型白酒酿造菌群结构组成及来源分析

胡申才，杜艾明，李 良，张文双，董孝元

（1.武汉轻工大学生物与制药工程学院，湖北武汉 430023；2.黄鹤楼酒业有限公司，湖北武汉 430050）

清香型白酒具有“清香纯正，醇甜柔和，自然谐调，余味爽净”的风格特点，深受广大消费者的喜爱。酒体的风味主要是酿造微生物群在利用原料的代谢过程中而产生的，因此清香型白酒的这些风格特点既与清香型白酒的“清蒸清米查、地缸发酵、清蒸二次清”酿造工艺特点紧密相关联[1]，也与所用大曲、原材料和酒厂所处地域有关。不同发酵工艺条件可创造不同的温湿度及氧化还原等微生态环境，大米查、二米查酒醅通过混合微生物菌群进行多微共酵,微生物群落会随着发酵熟度的推进而不断演化交替。

尽管绝大多数的现代发酵食品是接种曲种酿造而成，但传统自然发酵中的内源性微生物常常能增强食品风味的丰富度。对奶酪表皮微生物菌群的研究结果表明，至少60 %的细菌和25 %的真菌来源于环境[2]。这些与环境特异性相关的菌群在赋予产品明显地域特征性方面发挥着重要作用[3]。白酒的发酵生产是在一个相对开放的空间里完成的，按生产工序来说，进入酒醅中的微生物主要来源于大曲，但也可能会来自所使用的水源、车间空气或墙壁及地面中的微生物[4]。白酒酿造过程中，探明不同发酵阶段的酒醅酿造核心微生物菌群组成及其来源，对于研究清香型白酒发酵机制与品质提高具有十分重要的意义。

高通量测序技术（High-throughput sequencing）一次能并行对几十万到几百万条DNA 分子进行序列测定，可以快捷方便的读取样品中复杂的微生物结构组成。近年来该技术发展迅速，可快速对混合微生物群体中原核微生物16S rRNA 或真核微生物ITS 基因的扩增序列进行测序分析，广泛应用于多菌种样品的微生物组成分析[5-6]，从而在探明复杂样品微生物菌群结构组成及丰度分析方面发挥重要作用。

本文拟采用高通量测序技术对大曲、车间空气及周围环境和酒醅中的微生物群落构成进行分析，得出各大曲、车间空气、用水及附着面环境（如墙壁和地面）等样品中主要微生物构成的差异，并比较分析与酒醅中主要微生物的关联性，以期为清香型白酒发酵功能菌的筛选及应用提供指导，从而酿造出质量更好、营养健康价值更高的清香型白酒。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大曲（DQ1、DQ2）、空气样品（KQ）、水样（SY）及墙壁和地面等附着面（HJ）和发酵酒醅（JP0、JP5、JP7、JP14 和JP28）均来自于湖北黄鹤楼酒业有限公司的清香型白酒车间。

总DNA 提取试剂盒：土壤DNA 提取试剂盒（DNeasy PowerSoil Kit），QIAGEN公司，德国。

1.2 仪器与设备

大气采集器：CD-1A，北京检测仪器有限公司；超净工作台：SW-CJ-IFD 型，苏州安泰空气技术有限公司；小型台式高速离心机：Centrifuge 5424 R型，Eppendorf；冷冻离心机：Dynamica 型；电泳仪：DYY6C 型，北京六一仪器厂；电泳槽：DYC2 型，北京六一仪器厂；凝胶成像系统：英国Syngene公司。

1.3 实验方法

1.3.1 取样方法

（1）大曲取样：将酒厂储存备用的大曲粉碎均匀，其中DQ2 为黄鹤楼酒厂的大曲，DQ1 为其他清香型白酒厂的大曲。

（2）空气取样[7]：在灭菌后的布氏漏斗与无菌滤纸套紧后连接上空气采集器，将布氏漏斗置于离地面1.5 m 高处，抽滤6 h，将滤纸上微生物用无菌生理盐水洗涤，备用。

（3）酿造用水取样：将车间用水1.0 L 经无菌过滤器过滤后，将微生物浓缩富集于过滤膜，将滤纸上微生物用无菌生理盐水洗涤，备用。

（4）墙壁和地面取样：采用无菌棉签擦拭墙壁和地面后，将棉签放入无菌生理盐水振荡洗涤，备用。

（5）酒醅取样：根据大米查酒酿造过程中的“前缓、中挺、后缓落”的温度-时间变化规律，分别取发酵第0、5 d、14 d、21 d和28 d的地缸酒醅样品，分别编号为JP0、JP5、JP7、JP14 和JP28。取样时从地缸酒醅面下约30 cm 处，采用五点取样法分别取中心和四周的酒醅，混匀备用。

1.3.2 样品DNA提取

使用QIAGEN 公司的土壤DNA 提取试剂盒（DNeasy PowerSoil Kit）从样本中提取DNA，使用Qubit®dsDNA HS Assay Kit检测DNA浓度。

1.3.3 样品高通量分析

样品DNA 抽提好后，交由金唯智测序公司利用Illumina Miseq 测序平台进行高通量数据测定，并进行相关数据分析。使用的PCR 引物由金唯智公司设计，原核生物16S rDNA 的扩增包括V3 及V4 的2 个高度可变区，采用包含“CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT”序列的上游引物和包含“GGACTACNVGGGTWTCTAATCC”序列的下游引物扩增V3 和V4 区。真核生物ITS rDNA 的扩增包括ITS2 可变区，采用包含“GTGAATCATCGARTC”序列的上游引物和包含“TCCTCCGCTTATTGAT”序列的下游引物扩增ITS2区。

2 结果与分析

2.1 稀释曲线（图1）

图1 不同样品的稀释曲线分析

本研究通过Miseq 平台扩增子测序技术，共检测了13 个酒醅样品。由图1 可知，所有样品细菌16S rRNA 基因和真菌ITS 基因的测序都达到或接近平台期，说明本次测序可覆盖样本中绝大多数微生物种群信息。

2.2 不同酿造阶段酒醅中细菌群落组成分析（图2）

图2 酒醅样品中原核微生物在门（A）和科（B）分类水平上的相对丰度

清香型白酒酿造过程中，随发酵时间不同，酒醅中微生物类别会因为氧气、pH 值和代谢产物等因子变化而不断演替。通过高通量测序得出的数据可得出在门、纲、目、科、属和种等不同分类水平上的相对丰度，在门水平上，由图2A 可知，主要是由厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）两大类菌组成，拌曲后的大米查入地缸后以厚壁菌门分类水平占绝对优势，相对丰度占比从入地缸时的17.0%到第28 天出缸的98.3%，且在5 d、14 d和21 d 的样品中相对丰度占比均达到了71.4 %以上。在科水平上，由图2B 可知，酒醅中原核微生物主要由乳杆菌科（Lactobacillaceae）、肠杆菌科（Enterobacteriaceae）和明串珠菌科（Leuconostocaceae）等组成，其中刚入缸的酒醅样品JP0 中还存有一类占比达到28.1 %的未知科（unclassified_unclassified）的原核微生物；随着发酵进程的深入，乳杆菌科微生物数量不断增加，肠杆菌科微生物在发酵后期数量急剧减少，而明串珠菌科微生物在酿造前期得到大量增殖，也许这跟发酵前期的酿造系统酸性环境的快速形成有关，而入缸时占据优势的未知科微生物数量在发酵50 d时几近消失。

2.3 不同酿造阶段酒醅中真菌群落组成分析（图3）

图3 酒醅样品中真核微生物在门（A）和科（B）分类水平上的相对丰度

一般来说在白酒酿造过程中，真核微生物的演替主要与糖化作用和酯化作用有关。从高通量测序的酒醅样品分析结果来看（图3），在门分类水平上，主要是由子囊菌门（Ascomycota）和接合菌门（Zygomycota）组成；在科分类水平上，主要包括毛霉科（Mucoraceae）、毕赤酵母科（Pichiaceae）、酵母科（Saccharomycetaceae）、发菌科（Trichocomaceae）、腹膜孢酵母科（Saccharomycopsidaceae）和一类酵母目中的未知科（o Saccharomycetales Unclassified）等微生物。由图3B 可知，入缸时的酒醅主要以毛霉科的霉菌为绝对优势，其占比可达82.0 %；在酿造前期以霉菌糖化作用为主，分解出足量葡萄糖后，可供酵母目中的未知科和酵母科等真核微生物利用，发酵至5 d 后，毛霉科微生物占比明显下降，但酵母目中的未知科和酵母科微生物快速增殖而明显占据优势；JP5 样品中的酵母目中的未知科占比达到了75.2 %，从7 d 直至出缸的28 d 时占比仍然一直保持在41.0%左右。

2.4 酒醅中微生物的溯源分析（图4）

白酒酿造过程复杂，是一个“多微共酵”固态发酵过程。一般来说，清香型白酒的酒体质量既与发酵原料、水质有关，也与酿造微生物紧密有关。就酒醅中的发酵微生物而言，大曲粉是其主要来源，但因为酿酒工艺相关操作是在一个相对开放环境中进行的，不可避免地会受到地面与墙壁面等环境来源微生物以及空气和水源微生物的影响。不同的地域环境，因为温湿度不尽相同，空气、水体及厂房墙壁等来源的微生物种类也千差万别。

图4 不同样品中原核或真核微生物在种分类水平上的分布热图

为了对酒醅发酵过程中的微生物进行溯源分析，将酒醅样品与大曲以及空气、水体及厂房壁面的样品中的微生物高通量测序数据进行了比较分析，比较后的差异度可由热图进行表征，图4A 和4B 分别表征了各个样品中原核和真核微生物在种分类水平上的热图分布情况。

由2.2 所述的酒醅细菌群落组成分析结果揭示出酒醅中的原核微生物主要由肠杆菌科、乳杆菌科和明串珠菌科等组成。由图4A可知，酒醅中含有1个属于肠杆菌科的泛菌属未知种（PantoeaUnclassified），在酒醅发酵的前期和中期含量可达12%～48.7 %，该菌可能来源于空气或大曲，因为该菌广泛分布于酱香和浓香型白酒的大曲或酒醅中[8]，该菌容易定殖于植物表面，因此该菌来源于大曲中高粱的可能性更大，且该菌也许易于飘散而释放到厂房车间的空气中，因此在空气样品中也能大量检测得到。在不同发酵阶段的酒醅中含有种类丰富的乳酸菌，如乳杆菌科中的开菲尔乳杆菌(L.kefiri)、未知乳杆菌（gLactobacillusUnclassified）、短乳杆菌(L.brevis)、副柠檬酸乳杆菌(L.paralimentarius)、清酒乳杆菌(L.sakei)、棒状乳杆菌(L.coryniformis)、干酪乳杆菌(L.casei)、马里乳杆菌(L.manihotivorans)和小片球菌（Pediococcus parvulus）、戊糖片球菌（P.pentosaceus），以及明串珠菌科中的明串珠菌属未知种（gLeuconostocUnclassified）、绿色魏斯氏菌（Weissella viridescens）和魏斯氏菌属未知种（gWeissellaUnclassified）等11 种乳酸菌。其中大多数的乳酸菌来源于酒曲，但开菲尔乳杆菌、清酒乳杆菌、棒状乳杆菌和小片球菌可能更倾向来源于厂房中的空气或厂房地面环境。另外，绿色魏斯氏菌酒醅来源不明，因为在空气、水体和厂房墙壁与地面，以及大曲中含量都很少，但其发酵至5 d时的占比可达53.17%，之后数量会急剧下降，7 d 时的占比含量就降到了4.17%，推测也许因其增殖能力非常强而短时间内可得到大量菌数，环境一旦改变又大量消亡。1 种涅瓦菌属未知种(gNevskiaUnclassified)虽然在水样中占到57.8%，但在酒醅中却几乎检测不到，这也说明了菌的生长会受到酒醅环境的选择。

图4A 显示出不同发酵阶段的酒醅主要含有7种真核微生物，如米根霉（Rhizopus oryzae）、毛霉属未知种（gMucorUnclassified）、扁平云假丝酵母（Candida humilis）、酵母属未知种（gSaccharomycesUnclassified）、赛瓦酵母（Saccharomyces servazzii）、毕赤酵母属未知种（Pichiasp 1 TMS 2011）、扣囊腹膜孢酵母（Saccharomycopsis fibuligera）。根据热图表征出的信息可推知扁平云假丝酵母、酵母属未知种和毛霉属未知种等3 种微生物更有可能是来源于空气和水样，赛瓦酵母来源于车间空气，而米根霉、毕赤酵母属未知种和扣囊腹膜孢酵母既有可能来源于大曲，也有可能来源于空气和水样，这可能是因为这些菌既可大量存在于空气中，又可在水管壁上附着生长。

3 讨论

不同的发酵食品有其自身不同的核心酿造微生物菌群结构组成，这些核心微生物既为发酵食品的风味赋予了特征性与多样性，也为稳定产品质量提供了重要保证[9]。

在清香型白酒的发酵历程中，不仅有酒曲中的微生物不断交替演化生长，而且在此过程中同样也能集成了多种环境中的复杂微生物种群。在不同发酵阶段的酒醅中含有开菲尔乳杆菌(L.kefiri)、短乳杆菌(L.brevis)、副柠檬酸乳杆菌(L.paralimentarius)、清酒乳杆菌(L.sakei)、棒状乳杆菌(L.coryniformis)等11 种乳酸菌，与山西汾酒、北京二锅头等清香型白酒酒醅酿造系统中的乳酸菌种也有着明显差别[10]，同时也发现对于真核微生物来说，在酒醅酿造系统中，接合菌门一开始占优势，但逐渐被子囊菌门取代了优势地位，子囊菌门不仅是清香型白酒酒醅中的优势真菌种群，也是浓香和酱香型白酒及食醋、面包等发酵食品中的优势真菌种群[11]，这也符合“霉菌先行糖化作用，酵母后行产醇和产酯作用”的认知理论，但与汾酒酿造系统所含有的子囊菌门酵母的种类与数量也有明显差别[12-13]。这也从侧面说明了不同酒企的清香型白酒，因为所用大曲和地域环境条件的不同，核心微生物菌群也存在明显差别。

白酒酿造系统相对开放，酿造过程跟制曲过程一样是一个“多微共酵”的过程，其中发生着复杂的生理生化反应。迄今为止，行业内对复杂微生态系统内存在着的微生物种类多样性和代谢多样性以及微生物各类群之间的相互作用关系还缺乏清晰的认识。因此有必要在对酿造过程中的菌群组成进行结构解析及溯源分析后，再结合分离培养技术和特征风味物质分析技术，进而挖掘出核心功能微生物资源，这有利于解决因不同原料和季节差异而导致的酒体非均一性问题。