Lowrry法测定蛋白浓度的最佳波长选择

张凤国,张永勤,邢明霞,许文廷,吕兴霜,王裕晓,王鹏博

(青岛科技大学 化工学院，山东青岛266042)

Lowrry法[1]作为一种蛋白浓度的测定方法，广泛应用于食品、医药、医疗诊断、酶制剂、生物化工等行业的蛋白浓度测定。相较于BCA法[2-3]、考马斯亮蓝(Bardford)G250法[4-5]、荧光光谱法[6]、紫外法[7]等蛋白浓度测定方法，Lowrry法的灵敏度最高[8]，因而测定不易受杂质干扰而广为采纳。迄今为止，有多项国家标准[9-10]将该方法应用于蛋白酶活力测定中的蛋白浓度测定;Sigma公司也出售相关试剂并提供相应的蛋白浓度测定方法[11]。

该法的测定原理是基于蛋白质分子中所存在的酪氨酸和色氨酸，它们与碱性硫酸铜作用形成铜-肽键络合物，后者与酪氨酸共同作用使酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸还原生成钼蓝和钨蓝，其颜色与酪氨酸含量成正比。

然而，目前文献所报道测定条件有多种，主要集中在两方面。其一，所用的Folin A试剂不同，有的使用Folin A(以下简称为Folin A法)[12]，而有的是Na2CO3(以下简称Na2CO3法)[9-11];其二，文献报道的检测波长有多种[13-25]。但有关测定波长方面的研究至今未见相关报道。NOLASCO-SORIA等[26]较全面地综述了蛋白酶活力测定方法中的Lowrry法，但并未评述其最适检测波长，也未比较Folin A试剂及其替代试剂Na2CO3间是否有差异，这为选择适宜的测定条件带来了混乱。因此，本工作拟对此进行必要的研究，以便正确地确定Lowrry法测定蛋白浓度的条件。

1 实验部分

1．1 材料与仪器

酪氨酸、酪蛋白，上海阿拉丁生化科技股份有限公司;牛血清白蛋白，美国Sigma公司;磷酸、钼酸钠、钨酸钠、溴水、硫酸锂、碳酸钠、硫酸铜、酒石酸钾钠、氢氧化钠、磷酸钠、磷酸二氢钠，国药集团化学试剂有限公司。

紫外-可见光分光光度计，UV2600型，日本岛津公司;移液器，赛默飞世尔(上海)仪器有限公司;电子天平，AL-201型，瑞士梅特勒-托利多公司。

1．2 试剂的配制

1．2．1 酪氨酸溶液的配制

将酪氨酸于105℃干燥至恒重，以减量法准确称取0.1 g(精确至0.000 1 g)，用水溶解并定容至100 m L，即得酪氨酸溶液(1 mg·m L－1)，用水按比例稀释1 mg·m L－1的酪氨酸溶液，充分混匀后，取10 m L加水定容至100 m L，配成100μg·m L－1的酪氨酸溶液。

1．2．2 Folin试剂的配制

参考LOWRRY等[1，12]的方法，方法需要配制Folin A液和Folin B液两种试剂。具体配制方法如下。

1．2．2．1 Folin A液

A1液:将4%Na2CO3(%为w/V，以下同)溶液和0.2 mol·L－1NaOH按照体积比1∶1混合;A2液:1%CuSO4·5 H2O和2%酒石酸钾钠按照1∶1的体积比混合，再将A1液与A2液按照50∶1的体积比混合，现用现配。

1．2．2．2 Folin B液

在2 000 m L的磨口回流装置中加入100 g的二水合钨酸钠、25 g的二水合钼酸钠、700 m L的蒸馏水以及50 m L体积分数85%的磷酸和100 m L的浓盐酸，充分混合后，微沸以小火回流10 h，再加入150 g的硫酸锂，50 m L的蒸馏水及数滴液体溴。然后开口继续沸腾15 min以除去多余的溴，冷却后用水定容至到1 000 m L容量瓶中，混匀后过滤，于棕色瓶贮存。该试剂经NaOH标定，其HCl的含量为2.016 mol·L－1。将该溶液与水分别按照1∶1和1∶2的体积比得到Folin B1也和Folin B2液。

1．3 实验方法

1．3．1 蛋白质浓度的测定

1．3．1．1 Folin A法

根据Lowrry法，将L-酪氨酸溶液0.4 m L与Folin A液2 m L充分混合10 min后，再加入Folin B液(原液与水1∶1稀释)0.2 m L，迅速混匀，于25℃水浴放置30 min后，用分光光度计在540～750 nm内进行波谱扫描。每个待测样品做3个平行样。

1．3．1．2 Na2CO3法

参照文献的方法[9]略有修改，将L-酪氨酸溶液0.4与2.0 m L的碳酸钠(0.4 mol·L－1)充分混合10 min后，加0.4 m L Folin B液(原液与水体积比1∶2)，迅速混匀，于25℃水浴放置30 min后，用分光光度计在540～750 nm内进行波谱扫描。每个待测样品做3个平行样。

1．3．2 标准曲线的绘制与波谱扫描

1．3．2．1 酪氨酸标准曲线的绘制与波谱扫描

分别将L-酪氨酸溶液(100μg·m L－1)按比例稀释成10个浓度梯度的L-酪氨酸溶液(0，5，10，20，30，40，50，60，70，80，100μg·m L－1)，每个浓度3个平行样，按照1.3.1的方法进行波谱扫描，并获得不同波长下的吸光度值。将L-酪氨酸的浓度范围分为8组，分别为0～20，0～30，0～40，0～50，0～60，0～70，0～80，0～100μg·m L－1，编号分别为1，2，3，4，5，6，7，8。以L-酪氨酸浓度为横坐标，以每个波长下各浓度的吸光度值为纵坐标，绘制上述8组每个浓度范围的标准曲线。

1．3．2．2 BSA标准曲线的绘制与波谱扫描

分别将牛血清白蛋白(BSA)溶液(0.50 mg·m L－1)按比例稀释成9个浓度梯度的BSA溶液(0，0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.35，0.40，0.50 mg·m L－1)，每个浓度3个平行样，按照1.3.1的方法进行波谱扫描，并获得不同波长下的吸光度值。将BSA的浓度范围分为5组，分别为0～0.10，0～0.20，0～0.25，0～0.30，0～0.40，0～0.50 mg·m L－1，编号分别为1，2，3，4，5，6。以BSA的浓度为横坐标，以每个波长下各浓度的吸光度值为纵坐标，绘制上述5组每个浓度范围的标准曲线。

1．3．3 激活剂对蛋白质测定的影响

将相同体积的BSA溶液与含有激活剂的PBS混合(2.2 mmol·L－1EDTA，11 mmol·L－1L-半胱氨酸，0.134 mmol·L－12-巯基乙醇)，并以不含激活剂的PBS为对照，分别按照1.3.1.1、1.3.1.2的方法，以水为空白进行测定。

1．3．4 数据处理与选择最佳波长的方法

采用Excel 2016进行图表及数据处理，并计算每个波长下的斜率、R2和截距;通过对各波长下线性回归的斜率、回归系数R2、线性截距、空白等进行综合评价，确定出最佳测定波长。

2 结果与讨论

2．1 检测波长对酪氨酸浓度测定的影响

为便于蛋白质浓度计算，过原点的线性回归方程为首选，因为在该条件下，蛋白溶液的稀释倍数不会影响测定结果。

利用Folin A法测定波长对酪氨酸标准曲线的斜率、R2和截距的影响见图1。

图1 测定波长对Folin A法测定酪氨酸标准曲线的斜率、R 2和截距的影响Fig．1 Effect of detection wavelength on the slope，R 2 and intercept of L-tyrosine standard curve by Folin A methods

标准曲线的斜率随波长增大而增大(图1(a))，但线性决定系数R2却随之降低(图1(b))，而且其浓度范围越宽，斜率越低，R2越差。究其原因是由于酪氨酸浓度为0的空白吸光度值(图1(c)内图)随波长的增大幅度明显大于酪氨酸在高浓度区域的增大幅度，从而导致截距增大(如图1(c)所示)。因此，选取截距趋近于0的波长区域(540～600 nm)是蛋白质测定时的最佳选择，在该波长区域的R2均在0.999 5以上。在酪氨酸的宽浓度范围(0～100μg·m L－1)以600 nm以下波长测量为宜，以555 nm为例，其线性回归方程为y＝0.008 58x＋0.000 2(R2＝0.999 9)。而高波长区域则适合于对低浓度(≤40μg·m L－1)的酪氨酸测定，以750 nm为例，其线性回归方程y＝0.013x＋0.011(R2＝0.998 2)。

与Folin A法相比，Na2CO3法的波谱曲线更加平滑，这可能与产物的稳定性有关。在Na2CO3法中，测定波长在660～750 nm区域内，其线性方程的变化趋势(图2的(a)、(b)、(c))同Folin A法的类似，其最高酪氨酸浓度范围为0～40μg·m L－1。该浓度范围在该波长区域内的线性方程均接近原点，如图2(c)所示，以检测波长750 nm为例，其回归方程为y＝0.012 5x＋0.002 8(R2＝0.999 3)。在测定波长540～660 nm区域内，酪氨酸标准曲线在0～100μg·m L－1浓度范围内均保持良好的线性关系(图2(b))。但是，酪氨酸浓度范围越宽，即，酪氨酸浓度越高，标准曲线的截距越大(图2(c))，虽然R2仍在0.999以上(图2的(b))。为便于蛋白质的准确测定，应选择过原点的高灵敏度的标准曲线，因此，测定波长660～665 nm为最佳选择，以665 nm为例，其线性方程为y＝0.010 3x＋0.000 3(R2＝0.999 7)，此结果与文献[11，20]报道相一致。

图2 测定波长对Na2 CO3法测定酪氨酸标准曲线的斜率、R 2和截距的影响Fig．2 Effect of detection wavelength on the slope，R 2 and intercept of L-tyrosine standard curve by Na2 CO3 methods

2．2 激活剂对两种酪氨酸测定方法的影响

Lowrry法除了可以用于测定酪氨酸，因酪氨酸是组成蛋白质的常见20种氨基酸之一，所以该法还可用于测定蛋白浓度、蛋白酶活力等酪氨酸组成物质的领域。但在蛋白酶活力测定方法中，为保持蛋白酶活力，常需加入2-巯基乙醇、L-半胱氨酸盐酸盐和EDTA等[27-29]相应的激活剂。这类蛋白酶有木瓜蛋白酶[30-31]、组织蛋白酶系列[32-34]等。因此，为了考察了激活剂对蛋白测定的影响，以牛血清白蛋白(BSA，0.167 mg·m L－1)为研究对象，以加激活剂和不加激活剂作对比，分别采用Folin A法和Na2CO3法进行蛋白浓度测定，并进行波谱扫描，结果见图3。

图3 激活剂对蛋白质测定的影响Fig．3 Effect of activators on the protein assay

从图3可以看出，在加入激活剂后，Folin A法和Na2CO3法测定值均增大，具体数值见表1。在Na2CO3法中，加与不加激活剂在680 nm下，其测定值相差84.5倍，且测定值在5.0(605～760 nm)以上，已超出测定范围;而在Folin A法中，在555 nm下测定的吸光度值则相差3.9倍。在实际应用中，激活剂已是不可或缺的一部分，用不加激活剂的酶活力测定方法去评估在激活剂存在下的蛋白酶活力，将不利于蛋白酶制剂的实际应用与研发。因此，相较Na2CO3法，Folin A法更有可能通过条件优化而达到定量测定条件。

表1 激活剂对Na2 CO3和Folin A法测定吸光度值的影响Table 1 Effect of activators on the BSA assay by Na2 CO3 and Folin A methods

2．3 检测波长对BSA浓度测定的影响

在蛋白质浓度测定中，往往以分子结构中含有L-酪氨酸单元的BSA作为参考物质计算待测溶液的蛋白浓度。由于待测溶液往往含有可能影响测定的非蛋白成分，因此，首选Folin A法研究波长对BSA标准曲线测定的影响，见图4。标准曲线随波长的变化情况与酪氨酸的类似，斜率随检测波长的增加而增加，其浓度范围越宽，斜率越低(图4(a))，R2越差(图4(b))，其最大值在550～600 nm区域。BSA浓度为0的空白吸光度值(图4(c)内图)随波长的增大幅度明显大于高浓度酪氨酸的增大幅度，从而导致截距增大，如图4(c)所示，随着蛋白浓度范围的增大，标准曲线的截距逐渐偏离原点，特别是在波长大于550 nm区域，截距明显增大，这不利于蛋白浓度的定量测定。

图4 测定波长对Folin A法测定BSA标准曲线的斜率、R 2和截距的影响Fig．4 Effect of detection wavelength on the slope，R 2，intercept of BSA standard curve by Folin A methods

综合图4的结果，当BSA在0～0.3 mg·m L－1范围内，其最佳检测波长为555 nm，其线性回归方程为y＝1.916 2x＋0.006 6(R2＝0.998 1);当BSA在0～0.25 mg·m L－1范围内，其R2在450～570 nm区域内维持在0.999以上，以560 nm为例，其线性回归方程y＝1.999 4x＋0.002(R2＝0.999);当BSA在0～0.2 mg·m L－1范围内，其R2在467～631 nm区域内维持在0.999 9以上，以630 nm为例，其线性回归方程y＝2.491 3x＋0.000 9(R2＝0.999 9)(见表2)。

表2 波长对Folin A法测定BSA标准曲线的影响Table 2 Effect of wavelength on the determination of BSA standard curve by Folin A method

3 结 论

以酪氨酸和BSA标准曲线为研究对象，对蛋白浓度的测定方法的波长及检测蛋白浓度的范围进行研究，对酪氨酸测定而言，在0～100μg·m L－1范围内，Folin A法在540～600 nm之间测定，线性相关性较好，其中截距在555 nm处是最低的，回归方程y＝0.008 58x＋0.000 2(R2＝0.999 9)，而Na2CO3法则是在660～665 nm线性相关性较好，以665 nm为例，其线性方程为y＝0.010 3x＋0.000 3(R2＝0.999 7)，相比于Folin A(555 nm)具有更高的灵敏度，特别适合于不需要2-巯基乙醇、L-半胱氨酸盐酸盐和EDTA等激活剂存在的蛋白酶活力测定中的蛋白浓度测定。Folin A法更适合于测定波长在600 nm以下的蛋白浓度测定以及含有激活剂的的蛋白酶活力测定中的蛋白浓度测定。在Folin A法中，BSA的最佳检测波长为555 nm，而在低浓度范围(0～0.2 mg·m L－1)，其R2在540～631 nm区域均保持0.999 9以上，以630 nm为例，其线性方程为y＝2.491 3x＋0.000 9(R2＝0.999 9)。