探讨DNA 条形码对摇蚊属物种界定的有效性

余海军，王 茜

（天津农学院水产学院/天津市水生生态及养殖重点实验室，天津 300384）

摇蚊属（Chironomus）隶属于双翅目摇蚊亚科（Diptera：Chironomidae），该属由德国昆虫学家Mei⁃gen 于1803 年建立，迄今为止全世界已记录种类达303 种；摇蚊属的幼虫可以生存于各种水体（尚未污染至严重污染的水体），其中宽叶摇蚊亚属（Lobochi⁃ronomus）在缺乏营养的水体中较为丰富，并且能耐受酸性环境，另一些摇蚊亚属喜欢生长在盐分较高的环境中，对重金属污染具有耐受性［1］。摇蚊属部分种类雄成虫能引起人类过敏性疾病；裸露在外和正在产卵的摇蚊属种类可以成为新鲜水体中鱼类（鳟鱼）的主要食物来源；在日常生活中，某些垂钓者所用诱饵也为摇蚊属幼虫［2］。

摇蚊属是摇蚊科最古老的属之一，由于种种历史原因，该属的研究在世界上一直存在很大的争议，属内物种的分类地位至今没有获得广泛的认可。依据中国摇蚊名录中统计，中国已有该属种类共23种，其中只有13种具有明确记录，另包括3种可疑种和7种只进行鉴定而没有正式发表的［3］。因此，摇蚊属的物种界定一直存在争议［3］。随着DNA 条形码的提出，其通过将基因组的标准部分提取一个或几个相对较短的基因序列，用于识别物种［4，5］；虽然使用DNA序列识别生物并不新颖［6］，但DNA 条形码能快速且可靠地识别所有生命形式的物种层次，包括动物、植物、真菌、微生物；其在论证物种群落组成、食物链和种内遗传变异方面也有所研究［7-9］；同时也扮演着生物安全和淡水生态监测中一个不可缺少的角色［10-13］。Lin 等［14］使用DNA 条形码对长跗摇蚊属（Tanytarsus）121 个形态种进行物种鉴定有效性分析，结果表明DNA 条形码明确区分出94.6%的先前通过形态学研究分类的长跗摇蚊属物种；Song 等［15］使用DNA 条形码对多足摇蚊属（Polypedilum）161 个形态种进行物种鉴定有效性分析，结果表明现已有研究中多足摇蚊属94.4%的种类能有效被DNA 条形码区分。

本研究基于编码细胞色素C 氧化酶甲基I（COI）基因对摇蚊属157 种的749 条DNA 条形码进行分析研究，并利用相关软件对摇蚊属类群进行了遗传距离和系统发育树的分析，目的是探索DNA 条形码在摇蚊属物种界定方面的有效性，同时为完善摇蚊科DNA 条形码数据库提供参考，以填补当前国内该属的研究空白。

1 材料与方法

1.1 分类抽取和收集信息

研究中695 条DNA 条形码数据为BOID 和Gen⁃bank 数据库提供，54 条为收集样本，采集于新疆、宁夏、海南、贵州、广西、天津、浙江等地；采集方式包括灯诱、马氏网、D 型网、扫网；将采集后的幼虫样本保存于95%乙醇中，成虫样本保存于85%乙醇中，并存于4 ℃冰箱，用于后续的形态学和分子学研究。

1.2 DNA 提取和PCR 扩增

本研究通过Qiagen DNA Blood and Tissue kit 试剂盒，采用摇蚊成虫的头、胸部和幼虫的腹部提取基因组DNA。提取后成虫的头、胸部保存到与翅、足和触角一致的玻片标本上，用Euparal 树胶封片，凭证标本均存于天津农学院水产遗传育种实验室。

使用通用引物LCO1490和HCO2198扩增COI条形码［16］。PCR 扩增反应体系为25 μL，包含12.5 μL 2×Es Taq MasterMix，上下游引物各0.625 μL，dd H2O 8.75 μL，DNA模板2.5 μL。通过Master Cycler Gradient进行扩增，扩增程序为98 ℃预变性10 s，94 ℃5 min，35个循环（94 ℃1 min，51 ℃1 min，72 ℃1 min），最后72 ℃延伸5 min；10 ℃保存。PCR 扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，送北京六合华大基因科技股份有限公司进行纯化测序。

1.3 序列分析和对比

各个基因片段都采用双向测序，根据测序公司返回的测序结果，使用软件SeqMan 7.1.0.44 观察峰图质量编辑序列［17］。将编辑好的FASTA 文件导入MEGA7.0 后选择标准密码子进行后续密码子比对。

用MEGA7.0 软件分析对比后，对各样本碱基的组成、简约信息位点、变异位点（Variable sites）、保守位点、自裔位点、平均碱基含量、遗传距离和碱基转换与颠换比值进行统计。选用Kimura-2-parameter（K2P）分子进化模型，节点处置信度为1 000，其他设置均为默认值，建立邻接树。

利用ABGD 软件分析mOTU 的数量［18］：将编辑好的FASTA 文件在线提交到ABGD 网站（http：//ww⁃wabi.snv.jussieu.fr/public/abgd/），选择K2P 模型，种内差异先验值P 为0.001～0.100，相对gap 宽度值X 为1.0，其余参数设置为默认值［15］。本研究的54 条DNA 序列及其相关信息均已上传BOLD（http：//www.boldsystems.org）数据库。

2 结果与分析

2.1 序列特征

研究共获得摇蚊属749 条DNA 条形码，其中实验 室 获 得54 条DNA 条 形 码，695 条 来 自BOID 和Genbank 数据库，所有序列的长度均为658 bp，各碱基的平均含量分别为A=26.56%，T=37.67%，C=18.82%，G=16.92%，序列存在碱基的偏倚性，C+G的含量显著低于A+T 的含量，特别是第三核酸位点A+T 的含量为85.15%。通过比对序列得出，信息位点有244个，占37.08%；变异位点有261 个，占39.67%。大部分的变异位点都集中在第三核酸位点，其比例为78.16%，表明在第三核酸位点上的碱基进化速率快。

2.2 遗传距离

在DNA 条形码研究中，种内与种间遗传距离的差异是一项非常重要的指标，当种间遗传距离大于种内遗传距离，就会形成一个明显的空白区［15，19］。

实验室共获得54 条DNA 条形码，形态鉴定约为12 种。结合BOID 和Genbank 数据库已下载的数据，分析统计共获得形态种约50 种。在MEGA 7.0软件中，对所有形态种进行分组，即60 个组。种内遗传距离为0～7.21%，平均值为1.10%；种间遗传距离为0.2%～19.4%，平均值为14.25%；种间平均遗传距离是种内平均遗传距离的12.95 倍，因此本研究的749 条形码数据存在明显的空白区。

Hebert 等［5］通过对无脊椎动物及脊椎动物11门13 320 个物种进行了DNA 条形码的研究，并提出了种间平均遗传距离大于种内平均遗传距离的10 倍作为区分物种的标准；随着DNA 条形码的深入研究，不同领域的学者对该标准进行了验证，在摇蚊科不同类群中也出现了相应的研究，详细结果见表1。

表1 摇蚊科不同类群遗传距离比较

2.3 系统发育树结果

本研究采用DNA 条形码分析中最常用的邻接法，基于54 条DNA 条形码明显分离出13 个分类操作单元，代表摇蚊亚科中12 个已命名的物种，结果显示DNA 条形码的鉴别结果与形态学鉴定结果一致（图1）。

图1 54 条DNA 条形码邻接树

2.4 ABGD 评估结果

ABGD 在线软件通过比较种内和种间的遗传距离，当种间最小遗传距离大于种内最大遗传距离时则出现空白区，DNA 条形码空白区的存在很容易将物种分开（图2）。

图2 749条DNA条形码基于K2P模型得到的遗传距离分类

基于ABGD 在线软件评估摇蚊亚科OTUs 的数量，即通过设定不同的阈值P，得到不同的OTUs 数量；随着P 增大，OTUs 的数量减少（图3）。当P 为0.002 637 时，749 条DNA 条形码被分为104 OTUs；P 为0.026 827 时，被分为61 OTUs。即OTUs 的置信区间可为61～104，ABGD 所评估的OTUs 的数量略大于形态评估的种类。当P 为0.037 276 时，被分为58 OTUs，最为接近邻接树法评估的分子操作单元数量，因此ABGD 方法评估749 条摇蚊亚科DNA条形码的遗传距离阈值为3%～4%。

图3 ABGD 在线评估OTUs的数量随P 的变化

3 讨论

目前为止，DNA 条形码技术存在5 种分析方法，即遗传距离的分析、遗传相似度的分析、系统发育树的分析、序列特征的分析和统计分类法的分析［21］，而在摇蚊DNA 条形码研究中，主要是基于遗传距离和系统发育树的分析［22-28］。

基于遗传距离的分析，即通过计算DNA 条形码序列的遗传距离，从而实现物种的区分，主要分析方法包括DNA 条形码间隙和遗传距离阈值分析［21］。DNA 条形码间隙的一项非常重要指标是种内与种间遗传距离的差异，当种间遗传距离大于种内遗传距离，就会形成一个明显的空白区。本研究中种内平均遗传为距离为1.10%，种间平均遗传距离为14.25%，后者大约是前者的12.95 倍，形成了空白区。遗传距离阈值是指物种在能形成空白区的前提下，使用物种种间遗传距离与参比的遗传距离阈值进行对比，当种间遗传距离大于参比的阈值，则可以将物种区分为不同物种。阈值法在DNA 条形码的物种鉴定中起着不可替代的作用，然而随着DNA 条形码的研究不断出现，有学者发现不同物种DNA 条形码的阈值各不相同，没有一个统一的标准阈值［29］。BOLD 数据库最初将遗传距离1%作为生物物种的划分阈值，由于其阈值宽泛，在一定程度上造成了物种的鉴别过度，导致同种异名的出现，为了不使物种混乱，近年来BOLD 系统默认鉴别阈值为3%［30］；Meier 等［31］在对449 个双翅目昆虫物种的研究中，发现在物种划分时，其遗传距离大于3%；He⁃bert 等［5］以3%作为阈值对200 个鳞翅目昆虫物种进行鉴别；蜉蝣目［32-34］、襀翅目和毛翅目［35，36］的物种以2%的阈值就能将物种区分开。本试验研究的物种隶属于双翅目，通过使用ABGD 方法评估得到的遗传距离阈值为3%～4%，与Meier 等［31］的研究相符，且与摇蚊亚科中其他属研究的阈值差异不大，Song 等［15］区分多足摇蚊属的遗传距离阈值为5%～8%，Lin 等［14］区分长跗摇蚊属的遗传距离阈值为4%～5%。本研究是分析摇蚊属物种的DNA 条形码，其属于摇蚊亚科中比较大的属级之一，属内物种的丰富度极高，但由于时间有限，加之中国地大物博，从而不能完全覆盖已记录所有物种和一些隐种；为此还需要更深入的研究，才能达到对中国地区摇蚊属遗传距离的准确界定。

系统发育树能直观地反映物种之间的亲缘关系，本研究采用的是邻接树法，其基于遗传距离和最小进化原理，通过自举检验法进行聚类，并通过统计给定树分支的可信度，得出最优树［37］。在邻接树中，基于54 条来自实验室的DNA 条形码明显分离出12 个物种，与形态学鉴定结果一致，匹配率达92.3%；通过结合BOID 和Genbank 数据库中的695条DNA 条形码，分离出50 个形态种，其中发现本试验数据Chironomus pseudothummi 与参比数据Chi⁃ronomus sp.TE11 聚为一支（图4），由于数据库中参比数据Chironomus sp.TE11 不能提供证据标本与本研究比较，将基于本研究的数据将参比数据Chi⁃ronomus sp.TE11 修 改 为Chironomus pseudothummi，并将相关信息上传至BOLD 数据库。

图4 Chironomus pseudothummi 类群邻接树

4 结论

本研究通过采集中国地区的摇蚊属昆虫12 种54 个样本，结合BOID 和Genbank 数据库中的相关数据，共计749 条DNA 条形码，运用ABDG 法分析该数据集遗传距离，结果显示种内与种间存在一个明显的空白区；基于邻接树结果得出数据集分离出50 个物种，与传统形态学鉴定一致，匹配率高达92.3%，并修正数据库中Chironomus sp.TE11 为Chironomus pseudothummi，证明DNA 条形码能有效鉴别摇蚊属昆虫。本研究的数据均已上传中国DNA 条形码数据库，在丰富中国摇蚊科数据库的同时，也为探索DNA 条形码在摇蚊昆虫中鉴别的有效性提供了基础数据。