斑兰叶不同愈伤组织芽分化与抗氧化酶类关系

吉训志 秦晓威 杨艺秋 胡丽松 范睿 郝朝运

(1 中国热带农业科学院香料饮料研究所 海南万宁 571533;2 农业部香辛饮料作物遗传资源利用重点实验室 海南万宁 571533;3 海南省热带香辛饮料作物遗传改良与品质调控重点实验室 海南万宁 571533;4 云南农业大学热带作物学院 云南普洱 665000)

斑兰叶（Pandanus amaryllifolius Roxb.），又称香露兜、班兰叶、斑斓叶，属露兜科草本植物，是露兜科中唯一叶片具有芳香气味的品种［1-2］。斑兰叶拥有直立的地上茎，长而明亮的绿色剑形叶，发达的气生根，并且这种植物是不育的，几乎不开花，通过主茎上的芽进行繁育［3-4］。由于其叶片具有米香味，在东南亚及印度地区常被用于添加到蛋糕、饮品及菜肴中，以此提升食品风味［5］。斑兰叶叶片除了烹饪价值外，它还因其治疗特性，在民间医学中广为人知，鲜叶片的水提物有降火功效，对治疗内热、感冒、咳嗽和麻疹非常有效［6］。因此，斑兰叶在脱贫攻坚与间作增效方面的作用日益突出。近年来，除了对斑兰叶叶片的香气成分进行分析研究［7］，也有对其进行离体再生方面的研究。

斑兰叶花果未见，因此主要是以2年生以上老茎的侧芽进行分株繁育，通过愈伤组织诱导及丛生芽再生，能够极大地发挥其分化再生能力，无需拥有2年生的老茎，愈伤组织就能分化出大量丛生芽，以进行斑兰叶种苗的高通量繁育，此方法受外界环境影响较小，分化芽的生长状态相对一致，是基因工程育种的理想材料［8-9］。国内外也有学者对斑兰叶的组织培养技术进行了研究。王景飞等［10］利用香露兜地上茎，诱导丛生芽分化，生根成完整植株，并确定了最佳诱导条件，不过该文主要研究不同激素对芽的诱导与增殖影响，并未涉及愈伤组织诱导与斑兰叶组培再生的整个过程。Wakte 等［8］研究了斑兰叶从愈伤组织开始的分化再生过程，不过对于外植体材料的选择，没有明确的说明。而Gangopadhyay 等［9］也对斑兰叶的组培再生进行了探索，并通过以老茎上的侧芽为外植体获得了成功，不过该文主要是研究组培苗提高了2AP 香气成分，对于组培过程只是粗略提及。另外，斑兰叶处具有类似米香的特征香气外，还具有很强的抗氧化性而被关注［11-12］。不过斑兰叶抗氧化特性的研究主要针对于斑兰叶叶片，尚未见有关于斑兰叶愈伤组织及丛生芽的抗氧化特性研究报道。本研究在前人研究的基础上，探讨斑兰叶愈伤组织抗氧化酶与芽分化之间的关联，进一步完善建立斑兰叶的组织培养技术，为提高斑兰叶愈伤组织的芽分化率提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

材料来自于海南省万宁市兴隆热带植物园（18°15′，10°13′）的斑兰叶地，以上茎、嫩叶及老茎上的侧芽作为外植体材料。

1.2 方法

1.2.1 外植体材料培养

将长势健康的斑兰叶根蘖苗上的外植体放置在恒温箱（25±2℃）中培养，光照强度2 000 lx，光照时间12 h/d，培养40 d后观察试验材料的生长情况并进行取样。

1.2.2 外植体灭菌

选择无病害的健康植株，清水洗净后，将地上茎切成0.5 cm 的小段，健康的叶片切成0.5 cm2的面积大小，从3 年生的斑兰叶老茎上截取0.5～0.8 cm 的侧芽。将上述3 种外植体材料，用洗涤剂浸泡0.5 h 后，流水冲洗干净，转入超净工作台中，用75%酒精消毒30 s，无菌水洗涤3 次，再用0.1%升汞灭菌10 min，无菌水洗涤4～5 次，沥干水分后，接种到MS 培养基上培养10 d 左右统计外植体材料的污染率。

1.2.3 愈伤组织诱导

将上述无污染的地上茎、嫩叶及侧芽3种外植体接种到培养基1 和2（具体配方详见表1）两种愈伤组织诱导培养基上进行培养，40 d后观察愈伤组织诱导情况。

1.2.4 愈伤组织增殖及丛生芽诱导方法

将诱导得到的斑兰叶愈伤组织接种到培养基3、4、5（具体配方详见表1）上进行丛生芽的诱导，30 d后观察丛生芽分化情况。

表1 本试验用培养基

1.2.5 抗氧化酶类活性测定

挑取斑兰叶不同类型愈伤组织0.1 g，先将愈伤组织放在立体显微镜（STEMI 2000-C）上进行拍照记录，后装入2 mL离心管中加入1 mL酶活提取液与2 颗直径为0.3 cm 左右的小钢珠在高通量组织研磨机（TissueLyserⅡ，28 Hz，2 min）中进行粉碎后，8 000 r/min，4℃离心10 min，取上清液，利用苏州科铭生物技术有限公司的CAT、POD 与SOD试剂盒在双光束紫外可见分光光度计（UV2310Ⅱ）上对斑兰叶不同类型愈伤组织酶活性进行测定。

1.2.6 统计分析

将得到的数据结果用WPS office 2016 与IBM SPSS Statistics 25.0 软件进行处理，分析数据并生成图表。

2 结果与分析

2.1 斑兰叶的愈伤诱导及丛生芽再生

在对斑兰叶3种类型外植体材料进行灭菌的过程中发现，地上茎、嫩叶与侧芽在经消毒灭菌后没有呈现出褐化现象。不过在接种7 d 后，嫩叶四周开始有杂菌滋生，且污染率达92%左右；地上茎的污染发生在接种10 d 左右，内生菌丛地上茎接触培养基的部分开始延绵开来，污染率在30%左右；侧芽的污染情况也与地上茎相似，有时会整株覆盖霉菌，其污染率在28%左右；由此可见，斑兰叶内生菌较多，灭菌较为困难，需要进一步改进灭菌方法。

如表2 所示，在对斑兰叶3 种类型外植体材料诱导愈伤组织过程中发现，在培养30 d 左右，3 种外植体材料中只有侧芽在光培养14 d 时，在含TDZ与6-BA激素的培养基（培养基2）上侧芽基部开始膨大，继续培养，基部颜色由绿转白，在培养30 d左右，基部开始长出黄绿色的愈伤组织（图1-a），诱导率达79%左右，而在含2，4-D 和6-BA 的培养基上（培养基1）愈伤组织诱导率为13%；嫩叶与地上茎无论是光培养还是暗培养都没有萌动的迹象。

将斑兰叶愈伤组织转接到添加NAA与6-BA 的培养基上培养30 d 的过程中，基部愈伤组织不断增大，逐渐形成黄绿色，堆积成团与质地硬的大块愈伤组织块（图1-b），随后黄绿色愈伤组织部分开始变褐，不过愈伤组织块仍质地硬（图1-c）。将其转接到添加KT 与6-BA 的培养基或只含KT 的培养基上培养25 d 左右，含KT 与6-BA的培养基（培养基4）中愈伤组织的黄绿色部分开始分化出丛生芽（图1-d），丛生芽分化率都在90%左右（表2）；而只含KT 的培养基上，愈伤组织黄绿部分逐渐变白，褐化部分颜色变深成褐白色愈伤组织（图1-e），再继续培养25 d 左右，部分丛生芽会进一步伸长变粗，最终生成类似老茎上的侧芽结构。而褐白色愈伤组织则进一步变褐，变成黑褐色愈伤组织（图1-f），失去分化的能力。另外少数的黄绿色愈伤组织团会分化出粗壮的根系，进而影响丛生芽的分化与自身的增殖。5 种愈伤组织的分化关系为，侧芽基部愈伤组织（图1-a）先增殖分化为黄绿色愈伤组织（图1-b），在添加KT 与6-BA 的培养基上继续培养为黄褐色愈伤组织（图1-c），最终由黄褐色愈伤组织（图1-c）分化出芽，为芽分化愈伤组织（图1-d）；另一方面，在只含KT 的培养基上，黄绿色愈伤组织（图1-b）培养成褐白色愈伤组织（图1-e），继续培养为黑褐色愈伤组织（图1-f），无芽分化。

表2 不同培养方法愈伤组织诱导率、丛生芽诱导率对比

2.2 斑兰叶不同类型愈伤的抗氧化酶类比较分析

如图2所示，在对斑兰叶不同类型愈伤组织的过氧化氢酶（CAT）活性的测定中，不同类型愈伤组织的CAT活性相差不大，其中褐白色愈伤组织的CAT 活性显著低于其他，为91.43 U/g。黄绿色愈伤组织是斑兰叶开始芽分化时的状态，随后稍微变褐后再分化出丛生芽，这个过程中CAT活性呈先升后降的趋势，但黄绿色愈伤组织在转变成黄褐色愈伤组织再分化出的芽分化愈伤组织的CAT活性变化不大。另外从黄绿色愈伤组织生长成褐白色愈伤组织时，CAT 活性降低至接近于零，而后到黑褐色愈伤组织时的CAT 活性回升，但这2 种愈伤组织CAT活性都低于黄绿色愈伤组织。

在对斑兰叶不同类型愈伤组织的过氧化物酶（POD）活性的测定中，以黄绿色愈伤组织的POD活性最高，为6 237.17 U/g，黄褐色愈伤组织POD 活性最低，为2 144.94 U/g，其余的POD 活性相似。根据上述的斑兰叶愈伤组织芽分化过程，POD 活性呈现先降后升的趋势，其中黄褐色愈伤组织POD活性在显著下降后回升，使其转变成芽分化愈伤组织。而黄绿色愈伤组织的无分化途径中，POD 活性有所下降后就无变化，这使得褐白愈伤组织没有进行分化，进而变成黑褐色愈伤组织。

在对斑兰叶不同类型愈伤组织的超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定中，不同类型愈伤组织的SOD 活性普遍较低，其中褐白色愈伤组织的SOD 活性最高，为513.05 U/g。斑兰叶愈伤组织芽分化过程中，SOD 活性呈先升后降的趋势，其中黄褐色愈伤组织的SOD活性要高于黄绿色愈伤组织与芽分化愈伤组织的SOD活性，其中黄绿色愈伤组织比芽分化愈伤组织SOD活性还低。而黄绿色愈伤组织的无分化途径中，也呈先升后降的趋势，褐白色愈伤组织SOD活性显著高于黄绿色愈伤组织与黑褐色愈伤组织SOD活性，而黄绿色愈伤组织与黑褐色愈伤组织SOD活性都较低。

图1 斑兰叶不同类型愈伤组织及诱导丛生芽

图2 斑兰叶不同愈伤组织类型的抗氧化酶活性比较分析

3 讨论

3.1 斑兰叶的愈伤诱导及丛生芽再生

组培快繁是基于细胞全能性的理论，首先通过以母本组织为外植体，在适当的环境下诱导出愈伤组织，并通过大量增殖愈伤组织来替代直接截取母体组织，再将愈伤组织分化出丛生芽，将丛生芽分成多条芽段，最终生根成完整植株。本文在前人对于斑兰叶组培再生方面的研究基础上，明确了只有老茎上0.3 cm 左右的侧芽才具有再生分化能力。并且在丛生芽的诱导过程中，6-BA 与NAA 起到关键作用，而且愈伤组织在诱导丛生芽时，发现只含KT的培养基不能诱导丛生芽，而拥有6-BA激素的培养基才能诱导出丛生芽。这与前人的6-BA 在诱导丛生芽中起着关键作用的研究结果一致［13-14］。另外TDZ与6-BA才能激发侧芽基部分化出愈伤组织，24-D 主要用于愈伤组织的增殖，对于愈伤组织的诱导没有效果，这与前人研究成果不一致，也是对斑兰叶组培技术的新发现。斑兰叶愈伤组织诱导出来后，不能马上进行丛生芽诱导，要先进行愈伤组织约30 d 的继代增殖过程，一般需斑兰叶愈伤组织团增大至直径1.5 cm左右，再运用含6-BA激素的培养基，才能使愈伤组织大量分化出丛生芽，而这可能与其需要为再分化积累营养物质有关，这是对斑兰叶组培技术的补充。因此，本研究的成果是对斑兰叶组培再生技术的重要补充，为稳定建立斑兰叶组培技术体系提供技术支撑。

3.2 斑兰叶不同类型愈伤的抗氧化酶类比较分析

植物细胞的脱分化与再分化过程，不仅使细胞形态发生重大变化，还涉及一系列的生理生化特性的变化［15-16］。本文对不同类型愈伤组织的过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）与超氧化物歧化酶（SOD）等抗氧化酶类进行了比较研究，发现斑兰叶愈伤组织分化过程中的CAT 与SOD 活性的变化相似，都是先升后降，而POD 活性变化则相反。同时POD 活性在愈伤组织芽分化与无分化中都远高于CAT 与SOD 活性。另一方面在能分化出芽的黄褐色愈伤组织与不能分化出芽的褐白色愈伤组织中，前者的POD 活性显著低于后者的POD 活性，前者的CAT 活性高于后者的CAT 活性，而后者的SOD活性高于前者的SOD 活性。前人在对尾叶桉［17］与尾巨桉［18］的不同愈伤组织芽分化的抗氧化酶类活性关系的研究中，发现尾叶桉能够芽分化的浅绿色愈伤组织POD、CAT 与SOD 活性最高，同样在尾巨桉中POD 与SOD 活性高的愈伤组织芽分化的诱导率高。在对新疆雪莲［19］芽分化的抗氧化酶体系活性变化的研究中，发现胚性愈伤组织与非胚性愈伤组织的SOD活性在分化中都逐渐增大，而胚性愈伤组织的POD 活性要高于非胚性愈伤组织，CAT 也在芽分化时活性增大。上述的研究结果表明，抗氧化酶类对愈伤组织的芽分化起着重要作用，这与本文能够分化丛生芽的黄褐色愈伤组织POD活性高的研究结果一致，不过本文中不同类型愈伤组织的POD 活性都要高于CAT 与SOD。斑兰叶本身就具有较高的抗氧化活性［20］，因此一些愈伤组织就算不具备芽分化能力也具有较高的抗氧化酶活性，本研究结果显示POD可能在斑兰叶愈伤组织的抗氧化酶类中占据主要地位。另外，从不同培养基上诱导丛生芽的情况上看，只含KT 的培养基上，斑兰叶愈伤组织不能诱导出丛生芽，最终生长成黑褐色愈伤组织。不过黑褐色愈伤组织的CAT、POD与SOD 等酶活性与芽分化愈伤组织的酶活性相似，可能黑褐色愈伤组织仍具有芽分化的能力，可能缺乏6-BA 激素来促使丛生芽的分化，而这潜在的生理生化机制仍需要进一步研究。