EGFR/TGF-α/P-AKT/PTEN联合检测在非小细胞肺癌中的临床意义及相关性

袁 莉 李素霞 王卫华

菏泽医学专科学校药学与检验系，山东 菏泽 274000

肺癌在全球恶性肿瘤发病率和死亡率中位居第一，2012年全球癌症调查报告中显示，中国新增肺癌患者307万，其中死亡人数达到220万人，占全球总发病率和死亡率的21.9%和26.8%，位居第一[1-3]。在我国最常见的肺癌类型为非小细胞肺癌，占肺癌总发生率的75%～85%[4-5]。NSCLC的发生和发展与多基因突变有关，而癌基因的激活和抑癌基因的缺失使细胞异常增殖，是肿瘤发生的主要原因。研究表明，PI3K/AKT通路的过度活化存在于多种肿瘤组织中[6-7]，EGFR作为该通路上游调节因子，可以激活PI3K，进而促使AKT磷酸化。活化的AKT(P-AKT)是PI3K/AKT信号通路发挥作用的关键，可以磷酸化下游多种蛋白分子，如BAD、mTOR等，由此发挥抗细胞凋亡和促细胞增殖作用。TGF-α属于表皮生长因子家族，可与细胞膜上的EGFR结合，促使其活化，引发一系列级联反应。PTEN是发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因，可以使磷酸化磷脂酰肌醇D3位磷酸基发生脱磷酸作用，由此拮抗PI3K/AKT信号通路的活化。EGFR、P-AKT、和TGF-α在恶性肿瘤的信号传导中关系密切，本研究应用免疫组化方法检测以上蛋白表达，同时采用原位杂交方法检测PTEN的基因表达，探讨其与非小细胞肺癌临床病理特征的关系及各因子之间的相关性，为非小细胞肺癌的早期诊断和靶向治疗药物的选择与研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 组织标本

选择菏泽医专附属医院2008年1月—2015年12月手术切除后经两位病理专家明确诊断为NSCLC的存档石蜡标本73例，男性60例，女性13例；年龄≤51岁18例，>51岁55例。参照WHO肺癌分类标准进行分类，腺癌27例，鳞癌46例；高中分化50例，低分化23例；有淋巴结转移40例，无转移33例；远处转移28例，无转移45例。选取10例同期手术切除的炎性假瘤并远离病灶2 cm的正常肺组织作为对照组。所有病例均未接受放化疗。

1.2 试剂

鼠抗人EGFR单克隆抗体、PTEN原位杂交试剂盒均购自福建迈新生物技术有限公司，兔抗人P-AKT多克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司，兔抗人TGF-α多克隆抗体购自上海晶天生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1免疫组化检测 所有切片分别做HE染色和免疫组化染色(Maxvision二步法)，操作步骤严格按照说明书进行，组织抗原经高压修复5 min，滴加Maxvision试剂，孵育、冲洗、DAB显色、苏木素复染，封片。用已知阳性切片做阳性对照，PBS代替一抗做阴性对照。

1.3.2原位杂交检测 操作方法严格按照说明书进行，石蜡切片经常规脱蜡至水，预杂交、杂交、恒温箱38～42℃过夜，滴加封闭液、生物素化鼠抗地高辛、SABC、生物素化过氧化物酶等，DAB显色，冲洗，苏木素复染，封片。

1.4 结果判断

EGFR的着色部位位于细胞浆和细胞膜，P-AKT的着色部位位于细胞浆，TGF-α、PTEN的着色部位均位于细胞浆和细胞核。参考相关文献[8-9]并做适当修改制定本研究的判断标准。所有切片在光学显微镜下观察，随机选取5个高倍视野(×400)，每个视野计数100个癌细胞，计算阳性细胞所占百分比。显色癌细胞<10%为0分，10%～25%为1分，26%～50%为2分，>50%为3分；再按照显色癌细胞染色强度计分，无染色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，黄褐色为3分。每例积分为显色细胞比例和染色强度的乘积，2分以下为阴性(-)，3分以上为阳性(+)。

1.5 统计学分析

应用SPSS 19.0软件进行统计学分析，各因子按照不同临床病理特征分组，每组间比较采用χ2检验，各因子之间的关系采用Spearman等级相关性分析。检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 EGFR、P-AKT、TGF-α、PTEN在NSCLC和正常肺组织中的表达

在NSCLC和正常肺组织中，EGFR的阳性率分别为68.5%(50/73)、30.0%(3/10)，P-AKT的阳性率分别为76.7%(56/73)、30.0%(3/10)，TGF-α的阳性率分别为72.6%(53/73)、20.0%(2/10)，三因子在NSCLC中的表达显著高于正常肺组织，差异有统计学意义(P<0.05)。PTEN在NSCLC和正常肺组织中的阳性率分别为30.1%(22/73)、80.0%(8/10)，在正常肺组织中的表达显著高于NSCLC，差异有统计学意义(P<0.05，见表1、图1～4)。

图1 EGFR在中分化肺鳞癌中的表达(×400)

图3 P-AKT在低分化肺腺癌中的表达(×400)

表1 EGFR、P-AKT、TGF-α、PTEN在非小细胞肺癌和正常肺组织中的表达[n(%)]

2.2 EGFR、P-AKT、TGF-α、PTEN与临床病理特征的关系

在有淋巴结转移、有远处转移及低分化组中，EGFR的阳性率分别为90.0%(36/40)、96.4%(27/28)、87.0%(20/23)，P-AKT的阳性率分别为87.5%(35/40)、92.9%(26/28)、95.7%(22/23)，TGF-α的阳性率分别为85.0%(34/40)、92.9%(26/28)、91.3%(21/23)，PTEN的阳性率分别为12.5%(5/40)、10.7%(3/28)、8.7%(2/23)，EGFR、P-AKT和TGF-α的表达明显高于无淋巴结转移、无远处转移及高中分化组，而PTEN的表达却明显低于无淋巴结转移、无远处转移及高中分化组，差异均具有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 NSCLC中EGFR、P-AKT、TGF-α、PTEN的表达与临床病理特征的关系

2.3 EGFR、P-AKT、TGF-α、PTEN表达之间的相关性

经Spearman等级相关分析，PTEN基因和EGFR蛋白表达呈负相关(r=-0.454,P<0.001)，PTEN基因和P-AKT表达呈负相关(r=-0.486,P<0.001)，PTEN基因和TGF-α表达呈负相关(r=-0.668,P<0.001)，TGF-α和EGFR蛋白表达呈正相关(r=0.311,P<0.001)，TGF-α和P-AKT蛋白表达呈正相关(r=0.316,P<0.001)，P-AKT和EGFR蛋白表达呈正相关(r=0.324,P=0.005)，各因子间的相关性均有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 EGFR、P-AKT、TGF-α、PTEN表达之间的关系

3 讨 论

本实验结果显示，EGFR在NSCLC中的蛋白表达显著高于正常肺组织，并与淋巴结转移、远处转移及分化程度有关，提示EGFR不仅参与NSCLC的发生，还可能促进癌细胞的侵袭转移，可以作为评判NSCLC恶性程度的指示因子。多项研究均已证实EGFR作为PI3K/AKT信号通路的上游调节因子，其基因突变所致的蛋白过度表达，是该通路过度活化推动NSCLC发生发展的重要原因[10-12]。张萍等[13]的研究结果显示，406例晚期肺腺癌患者中，EGFR基因突变为205例，突变率达到了50.5%，其中19号外显子缺失突变和21号外显子L858R点突变最多见；Inoue等[14]报道中指出EGFR基因突变阳性是采用靶向药物EGFR-TKI治疗的重要预测指标，由此说明EGFR不仅可以作为NSCLC恶性程度的指标，也是基因靶向治疗的重要靶点及预后指标。

TGF-α作为表皮生长因子家族成员之一，可以与细胞膜上EGFR细胞外结构域结合，使EGFR与其他EGFR和HER家族成员形成二聚体并发生磷酸化，活化的EGFR进一步激活PI3K/AKT信号通路，参与多种癌细胞的生长历程[15]，同时多研究发现TGF-α是引起肿瘤耐药，降低临床疗效的原因之一[16-17]；研究显示血清中TGF-α的表达水平可以预测多肿瘤化疗后分子响应的失败率[18]；朱文良等[15]研究显示，血清中TGF-α的表达水平可以预测NSCLC采用EGFR-TKI靶向治疗的疗效。在本研究中也显示，TGF-α蛋白在NSCLC中表达高于正常肺组织，并且与EGFR呈正相关，共同推动NSCLC的发生发展，TGF-α不仅是EGFR的配体，也可以作为EGFR-TKI靶向治疗后的预后指标。

AKT是1977年Staal等[19]研究发现的一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，又称PKB。AKT虽是原癌基因，但未磷酸化的AKT是没有活性的，研究表明，AKT作为PI3K/AKT信号通路的关键因子，可以被多因子激活[20]，PI3K与PIP3相互作用，促使AKT结构中的催化结构域Thr308和调节结构域Ser473共同磷酸化，由此激活AKT(P-AKT)。多项研究显示，EGFR基因突变和PTEN基因缺失通过级联反应可激活AKT，P-AKT继续磷酸化下游蛋白分子，由此抑制细胞调亡，促进肿瘤细胞生长增殖及侵袭转移[21-22]。本实验结果显示，P-AKT在NSCLC中高表达，与淋巴结转移、远处转移和分化程度有关，并且与EGFR、TGF-α呈正相关，与PTEN呈负相关，说明P-AKT不仅参与NSCLC的发生，也提示EGFR、TGF-α的蛋白高表达及PTEN基因缺失促使AKT活化，催化NSCLC的增殖和转移，与以上研究一致。

1997年，Steck等[23]研究人员发现染色体10q23等位基因缺失常伴有多种肿瘤的发生，后来研究人员在该位点发现一种抑癌基因，这种抑癌基因可以编码具有蛋白酪氨酸磷酸酶活性的蛋白质，该抑癌基因即PTEN。PTEN具有双特异性磷酸酶活性，当其编码的产物以磷脂为底物时，可促使PIP3脱磷酸，拮抗PI3K/AKT信号通路，防止细胞的失控性生长。多研究表明，PTEN基因的缺失促使PI3K/AKT通路过度活化，推动多系统肿瘤的发生[24-26]。本实验结果显示，PTEN在NSCLC中的基因表达显著低于正常肺组织，并且与P-AKT呈负相关，提示PTEN基因的缺失通过级联反应活化AKT，促进NSCLC的增殖和转移，另外，PTEN与EGFR、TGF-α也呈负相关，提示EGFR、TGF-α的高表达可能是引起PTEN基因缺失的原因之一。

综上所述，EGFR、TGF-α和P-AKT的高表达以及PTEN基因缺失在NSCLC的生长增殖和侵袭转移中发挥着重要作用，可以作为NSCLC检测和预后的指标以及靶向治疗药物的研究靶点。