微小RNA-21调控同源性磷酸酶-张力蛋白基因表达在子痫前期发病中的作用机制

2021-04-09杨慧丽杨俊娟李新敏

安徽医药 2021年4期

杨慧丽，杨俊娟，李新敏

作者单位：郑州市妇幼保健院，a妇产科，b病理科，河南郑州450053

子痫前期（preeclampsia，PE）是妊娠期常见并发症，好发于妊娠20周以后，多表现为血压升高和尿蛋白等症状，但其病因尚不明确，临床治疗仅限于对症治疗、尽量延长孕周，尚无特效疗法，我国孕妇发病率达5%～10%，是引起孕产妇和围生儿死亡的主要原因。目前普遍认为，PE与滋养细胞浸润过浅导致胎盘浅着床有关，滋养细胞对母体子宫内膜的适当浸润对维持正常妊娠非常重要，但其调控机制尚不清楚。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类内源性非编码小RNA，可通过与靶mRNA 3ˊ非编码区（3ˊ-untranslated region，3ˊUTR）完全或不完全互补结合抑制其转录后表达，与细胞增殖、分化和凋亡等生物学活性有关，最新研究表明，miRNA 与PE 发生发展关系密切，有望成为其新型诊断标志物及治疗靶点。miR-21是一种癌基因，与多种肿瘤细胞侵袭、转移等有关，与PE的关系及对滋养细胞的影响少有研究。滋养细胞浸润母体子宫内膜机制与肿瘤侵袭、转移很相似，因此本研究拟探究miR-21 表达与PE的关系及对人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/SVneo细胞侵袭、凋亡的影响，并初步探究其可能调控机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2016年8月至2019年10月郑州市妇幼保健院收治的45 例PE 病人（PE 组）及45 例匹配正常孕妇（正常组）剖宫产手术中获得的胎盘组织。PE 病人年龄范围22～35 岁，年龄（28.02±3.15）岁，孕周（34.26±2.49）周，其中轻度PE 31 例、中度PE 12 例和重度PE 2 例。正常组孕妇年龄范围21～35 岁，年龄（26.92±3.47）岁，孕周（35.13±3.11）周，两组孕妇年龄、孕周等一般资料比较，差异无统计学意义（

=1.575、1.465，

=0.119、0.147），具有可比性。本研究经郑州市妇幼保健院伦理委员会批准通过（审批文号2016-〔S〕08），所有样品采集及资料调查均取得病人及其家属知情同意并签署知情同意书，符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》。

1.2 细胞、试剂及仪器

人绒毛膜外滋养层细胞（HTR-8/SVneo）细胞（上海康朗生物科技有限公司，货号kl-CC337655）；RPM 11640 培养基（美国Gibco公司，货号21870084）、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，美国Gibco 公司，货号10099141）；AnnexinVFITC 凋亡检测试剂盒（美国Sigma 公司，货号APOAF）；含miR-21种子序列的PTEN 3ˊUTR 野生型重组质粒（pmirGLO-PTEN-Wt）及突变型重组质粒（pmirGLO-PTEN-Mut）由广州锐博生物科技公司合成；Lipofectamine2000 转染试剂盒（货号11668）、miRNA 提取试剂盒（货号：AM1561）购自美国Invitrogen 公司；microRNA 定量试剂盒（货号638315）、TB GreenPremix Ex Taq™Ⅱ（Tli RNaseH Plus）（货号RR820A）购自TaKaRa 公司；一抗兔源anti-PTEN抗体（货号ab32199）、anti-p-PI3K（货号ab32089）、anti-p-AKT（货号ab38449）、anti-GAPDH 抗体（货号ab9485）、羊抗兔anti-IgG（货号ab205718）均购自英国Abcam 公司；引物、miR-21 模拟物（mimics）、抑制物（inhibitor）及无意义序列（scramble）由上海吉玛制药技术有限公司合成；双荧光素酶报告基因检测试剂盒（货号E1920）购自美国Promega公司等。

Evolution 220 紫外分光光度计、FC 型酶标仪、Forma Steri-Cycle i160 5%二氧化碳培养箱购自美国Thermo Fisher 公司；倒置荧光显微镜ix53 购自日本Olympus 公司；罗氏LightCycler96 实时荧光定量PCR 仪购自Roche 公司；CytoFLEX 流式细胞仪购自美国Beckman Coulter公司等。

1.3 方法

1.3.1

细胞培养及分组 HTR-8/SVneo 细胞常规复苏后采用含5%FBS、1%青链霉素的RPM 11640 培养基置于37 ℃、饱和湿度、5%二氧化碳培养箱培养。细胞传代时用0.25%胰蛋白酶消化。

1.3.2

细胞转染取对数期生长HTR-8/SVneo 细胞，消化计数后以5×10个/孔接种于6 孔细胞板，转染前1 d 更换为不含青链霉素的培养基孵育，采用脂质体2000 转染法将miR-21 mimics（mimics 组）、miR-21 inhibitor（inhibitor 组）及scramble（NC 组）序列分别转染至HTR-8/SVneo 细胞，另设无任何处理HTR-8/SVneo 细胞为空白对照组（BC 组），每组6 个复孔。转染后4～6 h 更换新鲜培养基，培养48 h 后收集细胞进行后续实验。

1.3.3

RT-qPCR miRNA 提取试剂盒提取PE 病人及正常胎盘组织、各组HTR-8/SVneo 细胞总RNA，紫外分光光度计检测其浓度及纯度，反转录的cDNA，-20 ℃保存备用。实时定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）法扩增miR-21、PTEN mRNA 表达。miR-21 正向引物序列（5’→3’）为GTGCAGGGTCCGAGGT，反向引物序列（5’→3’）为GCCGCTAGCTTATCGACTACG。内参U6 正向引物序列（5’→3’）为CTCGCTTCGGCAGCACA，反向引物序列（5’→3’）为AACGCTTCACGAATTTGCGT。PTEN 正向引物序列（5’→3’）为CCGAAAGGTTTTGCTACCATTCT，反向引物序列（5’→3’）为AAAATTATTTCCTTTCTGAGCATTCC 。内参GAPDH 正向引物序列（5’→3’）为AGAAGGCTGGGGCTCATTTG，反向引物序列（5’→3’）为AGGGGCCATCCACAGTCTTC。反应条件：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，34 s，40 个循环。2法分析miR-21 及PTEN mRNA相对表达水平。

1.3.4

WB 实验参照蛋白提取试剂盒操作说明提取PE 病人及正常胎盘组织、1.3.2 中四组细胞总蛋白，测定蛋白浓度后，置于-80 ℃冰箱保存备用。取50μg 蛋白样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，室温封闭，添加一抗（PTEN 1∶1 000；p-PI3K 1∶500；p-Akt 1∶1 000；GAPDH 抗体1∶500）4 ℃孵育过夜，TBST 缓冲液洗膜，添加二抗IgG（1∶5 000）室温孵育1 h，按上述方法洗膜，之后依次显色，曝片，以GAPDH为内参，观察并分析蛋白条带灰度值。

1.3.5 Tanswell

侵袭实验将对数期生长细胞铺板Tanswell小室，转染及分组同1.3.2，转染4 h后消化重悬细胞，以1×10/小室接再次种于上述Tanswell小室，添加培养基100 μL，24 h后乙醇固定、结晶紫染色，清洗，拍照，显微镜下随机选取5个视野进行计数求其平均值。

1.3.6

细胞凋亡检测将1.3.2 中四组细胞制成1×10/mL 单细胞悬液，参照AnnexinV-FITC 凋亡检测试剂盒说明书，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.3.7

双荧光素酶报告基因实验采用TargetScan 7.1（http：//www. targetscan. org/vert_71/）软件及miRTarBase软件（http：//mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php）预测人miR-21 的潜在靶基因及靶向结合种子序列位点。采用脂质体2000 转染法将miR-21 mimics+ pmirGLO-PTEN-Wt （mimics+Wt组）、scramble+ pmirGLO-PTEN-Wt（NC+ Wt 组）、miR-21 mimics+ pmirGLO-PTEN-Mut（mimics + Mut组）、scramble + pmirGLO-PTEN-Mut（NC+Mut 组）分别共转染至对数期生长HTR-8/SVneo 细胞，每组6个复孔。培养48 h 后，收集各组细胞，采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒测定各组细胞相对荧光信号强度，具体步骤严格按照试剂盒说明书进行。

2 结果

2.1 miR

21 及PTEN 在PE 病人及正常胎盘组织中表达情况比较

以正常胎盘组织中miR-21、PTEN mRNA 表达水平为1，PTEN 蛋白表达水平为（0.45±0.06），PE胎盘组织中miR-21（0.41±0.05）表达水平显著降低（

=79.157，

=0.000），PTEN mRNA（4.13±0.58）及蛋白（0.91±0.08）表达水平均显著增加（

=36.201、30.858，

=0.000、0.000）。PE胎盘组织中miR-21与PTEN表达水平呈负相关（

=-0.542，

＜0.05）。

2.2 miR

21对HTR

8/SVneo细胞侵袭的影响

BC组、NC组、mimics组和inhibitor组HTR-8/SVneo细胞侵袭个数分别为200.08±19.87、198.57±19.49、325.38±36.74、85.27±10.13，与BC、NC 组比较，mimics 组侵袭细胞数显著增加（

=13.01、13.16，

=0.00、0.00），inhibitor 组侵袭细胞数显著减少（

=11.92、11.76，

=0.00、0.00），均差异有统计学意义（

=103.70，

=0.00）。

2.3 miR

21对HTR

8/SVneo细胞凋亡的影响

结果见图1。BC组、NC组、mimics组和inhibitor组HTR-8/SVneo 细胞凋亡率分别为16.24±2.11、17.67±2.23、9.29±1.35、41.48±3.07，与BC组、NC组比较，mimics组凋亡率显著降低（

=7.49、9.03，

=0.00、0.00），inhibitor组凋亡率显著增加（

=27.20、25.65，

=0.00、0.00），均差异有统计学意义（

=228.40，

=0.00）。

2.4 miR

21 靶基因生物信息学分析

miRTarBase软件预测miR-21 与PTEN3ˊUTR 区存在靶向结合位点。见图2。

2.5 双荧光素酶报告基因实验

以转染NC+Wt相对荧光活性值为1，即（1.00±0.00），转染mimics+Wt 后HTR-8/SVneo细胞相对荧光活性（0.39±0.04）显著降低（

=37.355，

=0.000）。以转染NC+Mut相对荧光活性值为1，转染mimics+Mut后HTR-8/SVneo细胞相对荧光活性为（1.03±0.12），差异无统计学意义（

=0.612，

=0.554）。

2.6 miR

21 对HTR

8/SVneo 细胞PTEN、p

PI3K、p

Akt 蛋白表达的影响

与BC、NC 组比较，mimics组PTEN 表达水平显著降低（

=8.71、9.33，

=0.00、0.00），p-PI3K、p-Akt 蛋白表达水平显著增加（

=15.03、15.70、17.66、16.91，

=0.00、0.00、0.00、0.00），inhibitor 组PTEN 蛋白表达水平显著增加（

=20.53、19.91，

=0.00、0.00），p-PI3K、p-Akt 蛋白表达水平显著降低（

=12.70、12.03、7.51、8.27，

=0.00、0.00、0.00、0.00）。见表1、图3。

图1 凋亡流式术检测miR-21对HTR-8/SVneo细胞凋亡的影响：A为BC组；B为NC组；C为Mimics组；D为Inhibitor组

图2 miR-21与PTEN 3ˊUTR区的靶向结合位点

3 讨论

研究表明，多种miRNAs与PE发生发展有关。Schlosser等研究报道，循环miR-206和Wnt信号与女性PE病史及预后心血管疾病有关。Xie等研究报道，miR-320a上调通过靶向白细胞介素4抑制滋养细胞生长和侵袭，促进PE发生。Dong等研究报道，与对照组比较，晚发性PE病人循环中miR-21表达水平下调，有望成为晚发性PE的诊断标志。本研究结果发现，与正常组比较，PE组病人胎盘组织中miR-21表达水平显著降低，与其在癌症中表达趋势相反，可能与疾病异质性有关，提示miR-21与PE发生有关。

PTEN 即第10号染色体缺失性磷酸酶和张力蛋白同源物基因，是一个经典抑癌基因，其表达产物PTEN 蛋白同时具有磷脂酸酶和蛋白磷酸酶活性，在细胞生长发育、增殖凋亡、迁移、侵袭、信号传递等方面起重要调控作用，与PE 发生发展密切相关。Wu 等研究报道，PE 病人中PTEN 显著上调，过表达长链非编码RNA TCL6 可抑制滋养细胞增殖促进PE 发展，与靶向抑制PTEN 表达有关。Xue 等研究报道，PTEN 表达增加可通过调控AP-1 NF-κB 通路导致HTR-8/SVneo 细胞侵袭能力降低，促进PE 发展。薛平平等研究报道，过表达PTEN 可通过抑制PI3K/Akt 通路激活下调基质金属蛋白MMP-2、MMP-9 等表达抑制细胞迁移和侵袭，影响绒毛外滋养细胞侵入，促进PE发生。本研究结果发现，与正常组比较，PE组孕妇胎盘组织中PTEN显著增加，与miR-21呈负相关。且本研究通过双荧光素酶报告基因实验验证结果显示，与转染NC+Wt比较，转染mimics+Wt 后HTR-8/SVneo 细胞相对荧光活性显著降低，提示PTEN 是miR-21 下游靶向调控基因，PE发生可能二者表达水平异常有关。

miR-21 靶基因繁多，调控通路复杂，其中miR-21 靶向PTEN 调控PTEN/PI3K/Akt 通路影响肿瘤细胞增殖、凋亡等生物学活性相关研究屡见不鲜，但关于miR-21 靶向PTEN 对HTR-8/SVneo 细胞的研究尚鲜有。王辉等研究报道，AS-miR-21 通过负调控PTEN/PI3K/Akt 信号通路抑制非小细胞肺癌A549 细胞增殖、迁移。李欣然等研究报道，上调miR-21 可靶向抑制PTEN、PDCD4 基因表达对化疗诱导卵巢早衰大鼠具有显著治疗作用。本研究结果发现，与BC 组、NC 组比较，mimics 组HTR-8/SVneo细胞侵袭细胞数、p-PI3K、p-Akt蛋白表达水平显著增加，凋亡率、PTEN 蛋白表达水平显著降低，inhibitor 组呈相反趋势，提示过表达miR-21 可促进TR-8/SVneo 细胞侵袭，抑制其凋亡，可能与下调PTEN 蛋白表达激活PI3K/Akt 通路有关，抑制miR-21则呈相反趋势可再次印证以上结果。

表1 HTR-8/SVneo细胞PTEN、p-PI3K、p-Akt蛋白表达比较/±s

图3 HTR-8/SVneo细胞中PTEN、p-PI3K、p-Akt蛋白表达WB检测结果

综上所述，miR-21 在PE 病人胎盘组织中低表达，过表达miR-21 可通过靶向抑制PTEN 表达促进细胞侵袭并抑制其凋亡，可能与促进PI3K/Akt 通路激活有关，敲低miR-21 表达与之结果相反，可能对临床PE 发病机制及治疗提供新的靶点。本研究尚存在不足之处，miR-21 靶点基因繁多，是否有其他靶基因与PTEN 共同参与PE 发生及TR-8/SVneo 细胞侵袭，尚不清楚，有待进一步深入探究。