清脑止痛胶囊对偏头痛大鼠核因子-κB/诱导型一氧化氮合酶/环氧化酶2信号通路及痛觉敏感性的影响

金海燕，廖成俊，包雪鹦，李冕动，赖金玉，张惠光

作者单位：1深圳市龙岗区第三人民医院神经内科，广东 深圳518000；2解放军九六四医院神经内科，吉林 长春130000

偏头痛是一种临床常见慢性神经血管性疾病，病情复杂，易反复发作，伴有恶心、呕吐等先兆症状，发病率约7%～11%，严重影响人们生活质量。目前临床主要采用曲普坦类药物、5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）1B/1D 受体拮抗剂等进行治疗，但效果不佳，不能从根本上进行治疗，且对心血管系统有一定副作用，因此寻找新型治疗方案至关重要。本研究发现，清脑止痛胶囊（qingnaozhitong capsules，QNZT）可有效缓解大鼠偏头痛症状，可能与调节神经递质释放，改善脑、血管功能障碍有关，但涉及相关通路及具体机制尚不完全清楚。目前偏头痛发病机制中以三叉神经-血管学说占主导地位，该学说主要认为偏头痛发作与血管扩张、神经炎性反应密切相关。5-HT和一氧化氮（nitric oxide，NO）等分子可刺激神经系统产生炎症反应，核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是一种经典炎症信号通路，可参与环氧化酶2（Cyclooxygenase2，COX2）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等多种炎症介质表达调控，诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）可利用NO自由基，协助巨噬细胞在免疫系统中对抗病原体，与偏头痛发生机制有关。基于此，本研究拟探究QNZT对偏头痛大鼠NF-κB/iNOS/COX2信号通路及痛觉敏感性的影响，以期进一步揭示其可能作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

90 只健康雄性SPF 级Wistar 大鼠，体质量范围180～220 g，合格证号SCXK（吉）-2017-0003，由吉林大学实验动物中心提供。（24±2）℃温度、60%～70%湿度，12 h/12 h 光照/黑暗，自由饮水饮食环境下适应性饲养1周。研究起止时间为2019年2—6月。本研究对动物处置符合动物伦理学原则（动物伦理编号为20170920601）。

1.2 药品、试剂及主要仪器

清脑止痛胶囊（吉林敖东洮南药业股份有限公司，批号Z20080035，批次180625）；正天丸（华润三九医药股份有限公司，批准文号Z44020711，批次181119）；硝酸甘油（nitroglycerin，NTG）注射液（河南润弘制药股份有限公司，批号H20057216，批次180314）；大鼠iNOS ELISA 检测试剂盒（深圳子科生物科技有限公司，货号ZK-R3047）；大鼠NO ELISA检测试剂盒（上海沪震实业有限公司，货号hz-7309）；兔源anti-iNOS（货号ab353）、anti-NF-kB p65（货号ab207297）、anti-COX2（货号ab15191）、anti-GAPDH 抗体（货号ab181602）、二抗羊抗兔IgG（货号ab6721），均购自英国Abcam公司；热刺痛仪，购自上海软隆科技发展有限公司；EPOCH微孔分光光度计购自美国Bio Tek公司；ESJ60-4电子天平购自沈阳龙腾电子有限公司；Tanon-4200自动凝胶成像分析系统购自美国Tanon公司等。

1.3 方法

1.3.1

造模与分组 90 只大鼠随机分为6 组：空白组（NC组）、模型组（M 组）、阳性药物正天丸组（ZTW组，0.006 g/kg）、清脑止痛胶囊低（QNZT-L组，0.35 g/kg）、中（QNZT-M 组，0.70 g/kg）、高（QNZT-H 组，1.40 g/kg）剂量组，每组15只。以生理盐水溶解清脑止痛胶囊及正天丸，分别配置为0.035、0.070、0.140 g/mL的清脑止痛药液及0.000 6 g/mL 正天丸药液，药物处理组大鼠按10 mL/kg 的剂量进行灌胃，空白组、模型组以等量生理盐水灌胃，每天1 次，连续给药7 d。末次给药1 h 后，空白组于右肩皮下注射等量生理盐水，其余5 组注射10 mg/kg NTG 注射液复制偏头疼大鼠模型，当大鼠出现双耳发红、挠头，爬笼活动明显增加等行为时，表示造模成功。

1.3.2

各组大鼠行为学评分 造模成功后，记录各组大鼠在连续30 min内挠头、爬笼、咬尾及往返运动次数，每个症状出现1次记1分，共分0～30 min，60～90 min，120～150 min共3个时间段（造模成功记为0 min）。

1.3.3

各组大鼠痛觉阈值检测 分别将各组大鼠置于（55±5）℃热刺痛仪上，即开始计时，至大鼠出现抬足或缩足反应截止，这段时间记为大鼠痛觉阈值，规定60 s为最高痛觉阈值，≥60 s者均记为60 s。分别测定大鼠在造模成功后30 min、90 min、150 min痛觉阈值。

1.3.4

大鼠脑组织中NO、5-HT 水平检测 造模4 h后，2%异戊巴比妥钠腹腔麻醉处死，断头获得大脑，剪取0.5 g 脑组织置于液氮中保存备用，另取0.5 g制备脑组织匀浆液。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测大鼠脑组织中一氧化氮（NO）、5-HT 水平，具体操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.3.5

大鼠脑组织NF-κB p65、iNOS、COX2 蛋白表达量检测 采用免疫印迹法（western blot）检测1.3.4中采集的各组大鼠脑组织中NF-κB p65、iNOS、COX2蛋白表达量。采用蛋白抽提试剂盒提取脑组织总蛋白和细胞核蛋白，BCA 试剂盒检测蛋白浓度，置于-80 ℃保存备用。蛋白样品进行6%SDS-PAGE电泳2 h，PVDF 膜转膜70 min。5%脱脂奶粉室温封闭2 h，分别添加一抗anti-NF-kB p65（1∶200）、anti-iNOS（1∶400）、anti-COX2（1∶400）、anti-GAPDH（1∶500）4 ℃孵育过夜，TBST 缓冲液洗膜3 次，加入二抗羊抗兔IgG（1∶5 000）室温孵育1.5 h，洗膜，显色，曝片，于凝胶成像分析系统中观察结果并进行分析。

2 结果

2.1 各组大鼠行为学评分比较

NC 组大鼠未见异常行为学改变。在造模成功后0～150 min 内，与NC组比较，M 组、ZTW 组、QNZT-L 组、QNZT-M 组、QNZT-H 组大鼠均出现双耳发红，挠头次数增加，爬笼活动明显等行为，行为学评分增加（

P＜

0.05）；与M组比较，ZTW 组、QNZT-L、QNZT-M 组、QNZT-H 组大鼠挠头、爬笼次数减少，行为学评分降低（

P

＜0.05），其中QNZT-M 组、QNZT-H 组上述各指标均优于QNZTL 组（

P＜

0.05），而QNZT-M 组与QNZT-H 组比较差异无统计学意义（

P

＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠行为学评分比较/（分，±s）

2.2 各组大鼠痛觉阈值比较

与NC组比较，M组大鼠痛觉阈值降低（

P

＜0.05）；与M组比较，ZTW组、QNZT-L组、QNZT-M组、QNZT-H组大鼠痛觉阈值增加（

P

＜0.05）；QNZT-M 组、QNZT-H 组大鼠痛觉阈值高于QNZT-L 组（

P

＜0.05），QNZT-M 组与QNZT-H 组大鼠痛觉阈值比较差异无统计学意义（

P

＞0.05）。见表2。

2.3 各组大鼠脑组织中NO、5

-

HT 含量比较

与NC 组比较，M 组大鼠脑组织中NO 含量增加、5-HT含量降低（

P

＜0.05）；与M 组比较，ZTW 组、QNZT-L组、QNZT-M组、QNZT-H组大鼠脑组织中NO含量降低、5-HT 含量升高（

P

＜0.05）；QNZT-M 组、QNZT-H组大鼠脑组织中NO 含量低于QNZT-L 组（

P

＜0.05），5-HT 含量高于QNZT-L 组（

P

＜0.05），QNZT-M 组、QNZT-H组大鼠脑组织中NO含量、5-HT含量比较差异无统计学意义（

P＞

0.05）。见表3。

表2 各组大鼠痛觉阈值比较/（s，±s）

表3 各组大鼠脑组织中NO、5-HT含量比较/±s

2.4 各组大鼠脑组织NF

-κ

B p65、iNOS、COX2 蛋白表达量比较

与NC 组比较，M 组大鼠脑组织NFκB p65、iNOS、COX2蛋白表达量升高（

P

＜0.05）；与M组比较，ZTW 组、QNZT-L组、QNZT-M组、QNZT-H组大鼠脑组织中NF-κB p65、iNOS、COX2 蛋白表达量降低（

P

＜0.05），QNZT-M 组、QNZT-H 组大鼠脑组织中NF-κB p65、iNOS、COX2 蛋白表达量低于QNZT-L组（

P

＜0.05），QNZT-M 组与QNZT-H 组比较差异无统计学意义（

P

＞0.05）。详见表4，图1。

表4 各组大鼠脑组织中NF-κB p65、iNOS、COX2蛋白表达量比较/±s

图1 WB检测大鼠脑组织NF-κB p65、iNOS、COX2蛋白表达量

3 讨论

偏头痛模型目前公认的有NTG 致偏头痛模型、利血平化低5-HT伴局部脑血管痉挛致偏头痛模型、硬膜脑神经炎偏头痛模型等，其中NTG 可诱导细胞产生NO、iNOS 等因子，引起血管扩张，激活NF-κB信号通路，导致血管炎症发生，诱导偏头痛，与人类偏头痛生理过程最为相似。本研究采用皮下注射NTG 的方法复制偏头痛大鼠模型，结果发现，与NC 组比较，注射NTG 后大鼠出现双耳发红，挠头、爬笼等行为学反应，行为学评分增加，表明偏头痛大鼠模型制备成功，可用于后续试验。

在中医中偏头痛属“头风”范畴，多由外感、情志、内伤等引起，目前临床上尚无特效药，近来研究报道，较西医疗法中医治疗优势明显。QNZT由天麻、蒺藜、川芎、枸杞子、牛膝、香附、丹参、熟地黄、藁本、细辛组成，是一种中药复方制剂，其中天麻为君药，味甘性平，专入肝经，擅平肝火，清利头目；川芎为臣药，可升清开郁，活血止痛；配伍蒺藜可环周颅脑，增强除风止痛之效；佐以丹参活血化瘀、牛膝活血通络、香附理气解郁，复以枸杞子、熟地黄补肝养肾，可曲风清脑，化瘀止痛，且无不良反应，不产生依赖性。孙申国等研究发现，QNZT可减少老年偏头痛患者头痛发作，改善其恶心、呕吐等症状，且安全性好，另外QNZT 可降低大鼠脑组织TNF-α、IL-1β、NF-κB p65、COX2水平，缓解利血平致大鼠偏头痛症状。偏头痛发病机制学说中以三叉神经学说占主导地位，三叉神经激活诱发的脑内炎症可引起头痛发作及痛觉超敏反应，研究发现NO具有神经毒性，可引发三叉神经-血管反射，导致实验性偏头痛，5-HT受体激动剂可激动中枢5-HT受体，终止偏头痛急性发作。吴莎等研究报道，川芎-香附可通过升高NTG偏头痛大鼠5-HT水平，降低NO、NOS释放，发挥治疗偏头痛作用。本研究结果发现，与M 组比较，QNZT-L 组、QNZT-M组、QNZT-H组大鼠行为学评分、脑组织NO水平降低，脑组织5-HT水平、痛觉阈值升高，QNZT-M组、QNZTH 组大鼠脑组织5-HT 水平、痛觉阈值高于QNZT-L组，行为学评分、脑组织NO水平低于QNZT-L组，QNZT-M组与QNZT-H组大鼠各指标比较差异无统计学意义，表明QNZT可降低偏头痛大鼠行为学评分、脑组织NO水平，升高其脑组织5-HT水平、痛觉阈值，减轻偏头痛症状，并在一定剂量范围内呈剂量依赖性，进一步证实了以前的研究结果。

研究发现，NF-κB 信号通路参与偏头痛发病机制，NF-κB由p65与p50以不同形式存在的异源二聚体，活化后的NF-κB p65 由胞浆转入胞核发挥生物学活性，进一步激活iNOS，使脑血管扩张，血浆外渗，诱发神经性无菌性炎症，NO、TNF-α、COX2 等可作为NF-κB信号通路上游促炎因子刺激NF-κB信号通路激活。蒲玉婷等研究报道，颅痛颗粒可能通过下调NTG 致偏头痛大鼠脑干组织IL-1β、TNF-α、COX-2 表达，改善偏头痛大鼠行为学改变，但QNZT是否可调控偏头痛大鼠脑组织NF-κB p65/iNOS/COX2 信号传导目前还不清楚。本研究结果发现，与NC 组比较，M 组大鼠脑组织NF-κB p65、iNOS、COX2 蛋白表达量升高；与M 组比较，QNZT-L 组、QNZT-M 组、QNZT-H 组大鼠脑组织中NF-κB p65、iNOS、COX2 蛋白表达量降低，QNZT-M 组、QNZT-H组大鼠脑组织中NF-κB p65、iNOS、COX2 蛋白表达量低于QNZT-L 组，QNZT-M 组与QNZT-H 组比较差异无统计学意义，表明QNZT 可降低NF-κB p65、iNOS、COX2 蛋白表达量，抑制NF-κB p65/iNOS/COX2信号通路激活，缓解NTG 致大鼠偏头痛症状，升高其痛觉阈值，并在一定剂量范围内呈剂量依赖性。

综上所述，QNZT 可降低NO 水平、升高5-HT 水平，缓解偏头痛大鼠头痛发作，升高其痛觉阈值，改善其临床症状，并在一定剂量范围内呈剂量依赖性，抑制NF-κB/iNOS/COX2 信号通路激活可能是其药理机制。但NF-κB/iNOS/COX2 通路涉及信号因子较多，本研究未能一一检测各因子表达变化，尚存在不足，有待进一步深入探究。