芍药苷通过调控硫氧还蛋白结合蛋白表达对脂多糖诱导的肾小球系膜细胞氧化应激及凋亡的影响

刘俊英，郭志玲

作者单位：河南科技大学第一附属医院肾内科，河南 洛阳471003

免疫球蛋白A（IgA）肾病属于原发性肾小球肾炎，而肾小球系膜细胞异常增生及系膜基质增多是肾小球肾炎的主要病因。肾小球系膜细胞增殖与脂多糖（Lipopolysacharide，LPS）、炎性细胞因子等密切相关，其可促使多肽因子等致纤维化因子释放而促进细胞外基质合成进而引发肾小球肾炎。既往研究显示肾小球系膜细胞过度凋亡也可促进肾炎的发生。因而抑制肾小球系膜细胞凋亡对肾小球肾炎的治疗具有重要意义。研究表明芍药苷可减少活性氧（ROS）的含量从而减轻氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导的内皮细胞损伤。芍药苷可通过抗氧化作用减轻LPS 诱导的小鼠急性炎症脑损伤。但芍药苷对LPS 诱导的肾小球系膜细胞氧化应激及凋亡的影响尚未可知。研究表明硫氧还蛋白结合蛋白（thioredoxin interacting protein，TXNIP）在高糖诱导的小鼠肾小球系膜细胞中上调表达，TXNIP 表达下调可减少ROS 的产生而增强抗氧化能力。本研究从2018年1月至2019年7月期间采用LPS 诱导的肾小球系膜细胞，探讨芍药苷对肾小球系膜细胞氧化应激及凋亡的影响，分析其对TXNIP的调控作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

芍药苷购自陕西百草萃生物；LPS 购自美国Sigma；人肾小球系膜细胞HMCL 购自湖南丰晖生物。丙二醛（MDA）检测试剂盒购自武汉艾美捷；超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒购自日本同仁化学公司；谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）检测试剂盒购自上海酶联生物；细胞凋亡检测试剂盒购自北京索莱宝；兔抗人B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、B 淋巴细胞瘤-2 相关蛋白（Bax）、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved-Caspase3）抗体购自美国Abcam 公司；二抗购自美国Thermo Fisher Scientific；兔抗人TXNIP 多克隆抗体购自上海生工生物；TXNIP 小干扰RNA（si-TXNIP）、乱序无意义阴性序列（si-NC）购自广州锐博生物科技有限公司；pcDNA3.1 购自上海索宝生物科技有限公司；Lipofectamine2000 购自美国Invitrogen 公司；Trziol、反转录与荧光定量试剂盒购自日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1

药物处理及实验分组 HMCL 细胞随机分为对照组（Con 组）、LPS 组、LPS+芍药苷-低组、LPS+芍药苷-中组、LPS+芍药苷-高组，其中Con 组细胞未经LPS与芍药苷处理，其余各组均使用浓度为10 nmol/L的LPS诱导细胞，芍药苷不同剂量组分别加入终浓度为5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L的芍药苷处理细胞24 h。观察芍药苷对细胞凋亡及氧化应激指标的影响，筛选适宜浓度进行后续实验。后续研究为验证芍药苷与TXNIP的调控作用，将HMCL细胞随机分为LPS+si-NC 组（细胞中转染si-NC 24 h，用含有10 nmol/L的LPS处理细胞24 h）、LPS+si-TXNIP组（细胞中转染si-TXNIP 24 h，用含有10 nmol/L 的LPS 处理细胞24 h）、LPS+芍药苷+pcDNA组（细胞中转染pcDNA 24 h，用含有10 nmol/L的LPS与20 μmol/L的芍药苷共同处理24 h）、LPS+芍药苷+pcDNA-TXNIP组（细胞中转染pcDNA-TXNIP 24 h，用含有10 nmol/L 的LPS与20 μmol/L的芍药苷共同处理24 h）。

1.2.2

检测MDA、SOD、GSH-Px水平 各组细胞处理结束后，采用硫代巴比妥酸法测定MDA含量，采用水溶性四唑盐法检测SOD活性，二硫代二硝基甲苯酸法检测GSH-px活性，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.3

流式细胞术检测细胞凋亡 收集各组对数生长期HMCL 细胞，按照凋亡检测试剂盒说明书检测细胞凋亡率。

1.2.4

qRT-PCR 检测细胞中TXNIP mRNA 表达水平 收集各组HMCL细胞，采用Trizol法提取细胞总RNA，参照反转录试剂盒合成cDNA，按照荧光定量试剂盒且以cDNA 为模板配置qRT-PCR 反应体系，qRT-PCR 反应条件：94 ℃2 min（循环1 次），94 ℃20 s，58 ℃20 s，72 ℃20 s（循环40 次）。用美国ABI StepOnePlus 实时荧光定量PCR 仪计算TXNIP mRNA相对表达量。

1.2.5

Western blotting 检 测TXNIP、Bcl-2、Bax、cleaved-caspase3 蛋白表达 提取各组对数生长期HMCL细胞总蛋白，取30 μg蛋白进行SDS-PAGE，转膜，用5%脱脂牛奶室温封闭2 h，加入一抗稀释液（1∶500），4 ℃孵育24 h，加入二抗稀释液（1∶1 000），室温孵育1 h，ImageJ软件对蛋白进行半定量分析。

2 结果

2.1 芍药苷对脂多糖诱导的肾小球系膜细胞氧化应激的影响

与Con 组相比，LPS 组肾小球系膜细胞中MDA 含量升高（

P＜

0.05），SOD、GSH-Px 活性降低（

P＜

0.05）；与LPS组相比，LPS+芍药苷-低组、LPS+芍药苷-中组、LPS+芍药苷-高组肾小球系膜细胞中MDA 含量降低（

P＜

0.05），SOD、GSH-Px 活性升高（

P＜

0.05），见表1。

表1 芍药苷对脂多糖诱导的肾小球系膜细胞氧化应激的影响（重复次数=3，n=9）/±s

2.2 芍药苷对脂多糖诱导的肾小球系膜细胞凋亡的影响

与Con 组比较，LPS 组肾小球系膜细胞凋亡率增加（

P＜

0.05），相较于LPS 组，LPS+芍药苷-低组、LPS+芍药苷-中组、LPS+芍药苷-高组肾小球系膜细胞凋亡率降低（

P＜

0.05），见图1、图2、表2。

图1 芍药苷对脂多糖诱导的肾小球系膜细胞凋亡相关蛋白表达

表2 芍药苷对脂多糖诱导的肾小球系膜细胞凋亡的影响（重复次数=3，n=9）/±s

2.3 芍药苷对脂多糖诱导的肾小球系膜细胞中TXNIP表达的影响

与Con组相比，LPS组肾小球系膜细胞中TXNIP mRNA及蛋白表达量升高（

P＜

0.05）；相较于LPS组，LPS+芍药苷-低组、LPS+芍药苷-中组、LPS+芍药苷-高组肾小球系膜细胞中TXNIP mRNA及蛋白表达量降低（

P＜

0.05），见图3、表3。

图3 TXNIP蛋白表达

表3 芍药苷对脂多糖诱导的肾小球系膜细胞中TXNIP表达的影响（重复次数=3，n=9）/±s

2.4 干扰TXNIP 表达对脂多糖诱导的肾小球系膜细胞氧化应激和凋亡的影响

与LPS+si-NC 组相比，LPS+si-TXNIP 组肾小球系膜细胞中TXNIP 的表达量降低，MDA 含量减低，SOD、GSH-Px 活性升高，细胞凋亡率降低，Bcl-2蛋白表达量升高，Bax蛋白表达量降低（均

P＜

0.05），见图4、表4。

图4 干扰TXNIP表达对凋亡相关蛋白的影响

表4 干扰TXNIP表达对脂多糖诱导的肾小球系膜细胞氧化应激和凋亡的影响（重复次数=3，n=9）/±s

2.5 TXNIP 过表达逆转了芍药苷（20

μ

mol/L）对脂多糖诱导的肾小球系膜细胞氧化应激和凋亡的作用

与LPS+芍药苷+pcDNA 组相比，LPS+芍药苷+pcDNA-TXNIP 组肾小球系膜细胞中TXNIP 蛋白表达量升高（

P＜

0.05），MDA 含量升高（

P＜

0.05），SOD、GSH-Px 活性降低（

P＜

0.05），细胞凋亡率升高（

P

＜0.05），Bcl-2 蛋白表达量降低（

P＜

0.05），Bax 蛋白表达量升高（

P＜

0.05），见图5、表5。

图5 TXNIP过表达和凋亡相关蛋白表达

表5 TXNIP过表达逆转了芍药苷对脂多糖诱导的肾小球系膜细胞氧化应激和凋亡的作用（重复次数=3，n=9）/±s

3 讨论

肾小球肾炎可引起慢性肾功能衰竭，若肾小球炎症、氧化应激及损伤等过程中肾小球系膜细胞过度增殖可增加炎性细胞因子的释放量最终引发肾小球硬化。研究表明LPS具有趋化细胞的作用并可诱导肾小球系膜细胞增殖。因此本研究主要采用LPS处理肾小球系膜细胞，探讨芍药苷对肾小球系膜细胞氧化应激及凋亡的影响及其作用机制。

芍药苷可通过降低ROS水平而改善LPS诱导的H9C2 细胞氧化应激损伤。研究表明芍药苷可能通过下调ABCA1 表达而抑制LPS 诱导的THP-1 细胞炎症因子分泌及释放。相关报道指出芍药苷可抑制小胶质细胞的炎症反应。本研究结果显示LPS 诱导的肾小球系膜细胞HMCL 中MDA 含量升高，而SOD、GSH-Px 活性降低，提示LPS 诱导的HMCL 细胞氧化应激损伤模型构建成功。研究表明氧化应激可诱导细胞凋亡，MDA 生成量增加可加重氧化应激损伤，SOD、GSH-Px 属于抗氧化酶类，提高SOD、GSH-Px 活性可抑制氧化应激反应。本研究结果显示不同浓度的芍药苷均可降低LPS诱导的HMCL 细胞氧化应激产物MDA 生成，增加内源性抗氧化酶SOD、GSH-Px 活性而抑制LPS 诱导的氧化应激损伤从而发挥保护作用。研究报道指出细胞凋亡在肾病发生发展过程中发挥重要作用，高糖可诱导肾小球系膜细胞中Bax、cleaved-caspase3 的表达及抑制Bcl-2 的表达而促进细胞凋亡从而加重疾病严重程度。与上述研究报道相似，本研究结果显示LPS诱导的HMCL细胞中Bax、cleaved-caspase3蛋白表达量升高，Bcl-2 蛋白表达量降低，细胞凋亡率升高，说明LPS 可诱导肾小球系膜细胞凋亡。进一步研究结果显示，不同浓度的芍药苷处理后可抑制细胞凋亡及Bax、cleaved-caspase3 蛋白表达，而促进Bcl-2蛋白表达，提示芍药苷可通过调控细胞凋亡相关蛋白表达而抑制肾小球系膜细胞凋亡。

TXNIP可通过与硫氧还蛋白结合而抑制其抗氧化作用，并可促进ROS 生成引发氧化应激反应从而诱导细胞凋亡，研究表明TXNIP 介导的氧化应激在糖尿病肾病、动脉粥样硬化等多种疾病发生发展过程中发挥重要调控作用。研究表明人肾小管上皮细胞高糖缺氧复氧损伤中TXNIP 表达升高，抑制TXNIP的表达可减缓高糖缺氧复氧损伤。相关报道指出抑制TXNIP/NLRP3 信号通路可通过减轻氧化应激损伤而减轻肾脏损伤。与上述报道结果显示，本研究结果显示LPS 诱导的HMCL 细胞中TXNIP 的表达水平升高，不同浓度的芍药苷可降低TXNIP的表达，且随着芍药苷浓度的增加而降低，提示芍药苷可抑制LPS诱导的HMCL 细胞中TXNIP 的表达。本研究发现干扰TXNIP 的表达可降低HMCL细胞凋亡率，提高SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量，并可促进Bcl-2的表达，而抑制Bax的表达，提示干扰TXNIP 的表达可通过减轻氧化应激损伤从而对LPS诱导的肾小球系膜细胞发挥抗凋亡作用。本研究进一步分析显示TXNIP过表达可逆转芍药苷对LPS诱导的肾小球系膜细胞氧化应激与凋亡的作用，提示芍药苷可通过抑制TXNIP的表达而拮抗氧化应激对肾小球系膜细胞的损伤从而发挥保护肾脏作用。

综上所述，芍药苷可通过抑制TXNIP 的表达减轻LPS诱导的细胞氧化应激损伤，抑制细胞凋亡，可能作为保护肾小球系膜细胞的新型药物，有望为肾小球硬化、肾小球肾炎等肾脏疾病的临床治疗提供新方向。