长链非编码RNA膀胱癌相关转录本1靶向调控微小RNA-20b-5p对宫颈癌细胞自噬及顺铂敏感性的影响
2021-04-09柳月霞魏菊红刘小丽
柳月霞，魏菊红，刘小丽
作者单位：南阳市第二人民医院产一科，河南 南阳473000
宫颈癌是临床常见恶性肿瘤之一，近年来，宫颈癌发病率逐年上升，已严重威胁女性身体健康，临床常采用化疗等方法治疗中晚期宫颈癌病人，但部分病人可产生化疗药物耐药性从而降低治疗效果。因而如何增强宫颈癌化疗敏感新成为热点研究问题。研究表明细胞自噬在宫颈癌发生及发展过程中发挥重要调控作用，还可参与化疗耐药性发生过程。长链编码RNA 膀胱癌相关转录本1（Long noncoding RNA bladder cancer-associated transcript 1，LncRNA BLACAT1）在非小细胞肺癌中呈高表达，沉默BLACAT1表达可抑制细胞增殖。但BLACAT1对宫颈癌细胞自噬及顺铂敏感性的影响尚未可知。生物信息学分析显示微小RNA-20b-5p（microRNA-20b-5p，miR-20b-5p）可能是BLACAT1下游的靶基因，研究表明miR-20b-5p在肺腺癌中呈低表达，并可抑制肿瘤细胞增殖。因此，本研究主要探讨BLACAT1、miR-20b-5p在宫颈癌细胞株与耐药细胞株中的表达，分析其对细胞自噬及顺铂敏感性的影响机制，以期为宫颈癌治疗药物的研发提供新方向。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
人正常宫颈上皮细胞HUCEC、宫颈癌细胞株ME180、C-33A、Hela 购自美国ATCC公司；顺铂耐药宫颈癌细胞株Hela/DDP 购自广州吉妮欧生物；甲基噻唑基四唑（methylthiazolyl tetrazolium，MTT）购自上海泽叶生物；Lipofectamine2000 购自美国Invitrogen；Trizol、反转录及荧光定量试剂盒购自北京天根生化；BLACAT1 小分子干扰RNA（si-BLACAT1）及其阴性对照（si-NC）、miR-20b-5p 特异性寡核苷酸抑制剂（anti-miR-20b-5p）及其阴性对照（anti-miR-NC）、miR-20b-5p 寡核苷酸模拟物（miR-20b-5p mimics）及阴性对照mimic NC 序列（miRcon）购自上海吉玛；兔抗人p62、微管相关蛋白轻链3Ⅰ（LCB3-Ⅰ）、微管相关蛋白轻链3Ⅱ（LCB3-Ⅱ）抗体购自美国CST；二抗购自武汉博士德生物。1.2 方法
1.2.1
实验分组 本研究起止时间2018年6月至2019年10月。取对数期Hela/DDP 细胞，按照随机数字表法分为si-NC 组（转染si-NC）、si-BLACAT1 组（转 染si-BLACAT1）、si-BLACAT1+anti-miR-NC 组（共转染si-BLACAT1与anti-miR-NC）、si-BLACAT1+anti-miR-20b-5p 组（共转染si-BLACAT1 与anti-miR-20b-5p），各组转染前2 h 更换为不含胎牛血清的DMEM 培养基，转染6 h 后更换为DMEM 完全培养基，继续培养48 h后收集细胞。1.2.2
qRT-PCR 检测细胞中BLACAT1、miR-20b-5p 的表达水平 采用Trizol 法提取各组细胞中总RNA，根据反转录试剂盒说明书将总RNA 反转录合成cDNA，qRT-PCR 反应体系：SYBR Green Master Mix 10 μL，正反向引物0.8 μL，cDNA 1 μL，双蒸水（ddHO）补 足 体 系 至20 μL，用2法 计 算BLACAT1、miR-20b-5p的表达水平。1.2.3
MTT 检测细胞顺铂IC50 值 取对数期Hela/DDP细胞接种于96孔板（100 μL/孔），采用0.5、5、8、10、20 μg/mL 顺铂处理72 h，每孔加入15 μL MTT 溶液，37 ℃培养箱内继续培养4 h，弃培养基，每孔加入150 μL DMSO，利用酶标仪检测OD，用Msvbvm50软件计算细胞抑制率为50%时的顺铂浓度即顺铂IC50值。1.2.4
双荧光素酶报告基因检测BLACAT1 的靶基因 构建野生型载体WT-BLACAT1、突变型载体MUT-BLACAT1，分别将WT-BLACAT1、MUT-BLACAT1 与miR-con、miR-20b-5p mimics 共转染至Hela/DDP 细胞，37 ℃培养箱继续培养48 h，参照荧光素酶活性检测试剂盒检测各组荧光素酶活性。1.2.5
蛋白质印迹法（Western blotting）检测p62、LCB3-Ⅰ、LCB3-Ⅱ蛋白表达 提取各组Hela/DDP细胞蛋白，用SDS-PAGE 分离蛋白，转膜、封闭，加入p62（1∶800）、LCB3-Ⅰ（1∶1 000）、LCB3-Ⅱ（1∶1 000）一抗稀释液，4 ℃孵育过夜，TBST 洗涤，加入二抗稀释液（1∶2 000），滴加ECL 显影，应用Quantityone 软件检测条带灰度值。
2 结果
2.1 BLACAT1 在宫颈癌细胞中的表达
与HUCEC 相比，宫颈癌细胞株ME180、C-33A、Hela 中BLACAT1 的表达水平升高[（0.80±0.16）比（3.41±0.14）、（3.72±0.14）、（2.52±0.15）］（P
＜0.05）；与Hela相比，Hela/DDP 细胞中BLACAT1 的表达水平升高[（2.52±0.15）比（5.23±0.14）］（P
＜0.05）。2.2 BLACAT1 敲减抑制Hela/DPP 细胞自噬和增强细胞对顺铂药物敏感性
与si-NC组相比，si-BLACAT1组细胞中BLACAT1的表达水平降低（P
＜0.05），p62蛋白水平降低（P
＜0.05），LCB3-Ⅱ蛋白水平升高（P
＜0.05），顺铂IC50值降低（P
＜0.05），见图1、表1。
图1 BLACAT1敲减对顺铂处理的宫颈癌Hela/DDP细胞中自噬相关蛋白表达的影响
表1 BLACAT1敲减对顺铂处理的宫颈癌Hela/DDP细胞自噬相关蛋白表达的影响（n=9）/±s
2.3 BLACAT1 靶向结合miR
-20b
-5p
BLACAT1与miR-20b-5p 存在结合位点，见图2。miR-20b-5p过表达可降低野生型载体WT-BLACAT1 的荧光素酶活性（P
＜0.05），见表2。
表2 双荧光素酶活性检测Hela/DDP细胞中BLACAT1与miR-20b-5p的靶向关系（n=9）/±s
图2 BLACAT1与miR-20b-5p的结合位点
2.4 miR
-20b
-5p 在宫颈癌细胞中的表达
与HUCEC 相比，宫颈癌细胞株ME180、C-33A、Hela 中miR-20b-5p 的表达水平降低[（1.00±0.16）比（0.42±0.16）、（0.33±0.14）、（0.38±0.15）］（P
＜0.05）；与Hela相比，Hela/DDP 细胞中miR-20b-5p 的表达水平降低[（0.38±0.15）比（0.21±0.11）］（P
＜0.05）。2.5 miR
-20b
-5p 的敲减逆转了BLACAT1 敲减对Hela/DDP 细胞自噬及顺铂敏感性的影响
与si-NC组相比，si-BLACAT1组细胞中miR-20b-5p的表达水平升高（P
＜0.05）；与si-BLACAT1+anti-miR-NC 组相比，si-BLACAT1+anti-miR-20b-5p组细胞中miR-20b-5p 的表达水平降低（P
＜0.05），p62 蛋白水平显著升高（P
＜0.05），LCB3-Ⅱ蛋白水平降低（P
＜0.05），顺铂IC50值显著升高（P
＜0.05），见图3、表3。
表3 miR-20b-5p的敲减逆转了BLACAT1敲减对顺铂处理的Hela/DDP细胞自噬相关蛋白表达的影响（n=9）/±s
3 讨论
既往研究显示增强宫颈癌细胞自噬活性可能抑制肿瘤进展，如何将化疗药物与自噬诱导剂结合成为重点研究。但宫颈癌细胞自噬相关分子机制尚未完全阐明。研究表明LncRNA 在宫颈癌中异常表达并可调控细胞生物学行为。
图3 miR-20b-5p的敲减逆转了BLACAT1敲减对Hela/DDP细胞自噬相关蛋白表达的影响
BLACAT1在多种恶性肿瘤中呈高表达，并可作为肿瘤诊断及评估病人预后的重要指标。研究表明抑制BLACAT1 表达可降低非小细胞肺癌对阿法替尼的耐药性。相关报道指出BLACAT1 在肝细胞癌中表达量升高，并可促进肿瘤细胞生长。与既往研究结果相似，本研究结果显示BLACAT1在宫颈癌细胞株中的表达量增高，在宫颈癌耐药细胞株中的表达明显高于宫颈癌细胞，提示BLACAT1高表达可能促进宫颈癌细胞耐药性的发生。本研究结果显示抑制BLACAT1 表达后宫颈癌细胞中p62蛋白表达量降低，LCB3-Ⅱ蛋白表达量升高。研究表明LCB3-Ⅱ、LCB3-Ⅰ属于自噬标志物，细胞发生自噬时LCB3-Ⅱ表达升高，p62 属于自噬标记蛋白，p62 表达量升高可促进肿瘤发展。本研究结果提示抑制BLACAT1 表达可调控细胞自噬过程。同时本研究结果显示抑制BLACAT1 表达可能通过调节细胞自噬从而增强顺铂敏感性。
子宫内膜癌中LncRNA H19 通过抑制miR-20b-5p 表达从而促进肿瘤发生及发展。研究表明miR-20b-5p 在结肠癌、骨肉瘤等肿瘤中呈低表达，并可参与肿瘤发生及发展过程。与上述研究报道结果相似，本研究结果显示miR-20b-5p 在宫颈癌细胞中呈低表达，且在宫颈癌耐药细胞中的表达水平较低，提示miR-20b-5p 表达量减低可能降低宫颈癌细胞顺铂敏感性。本研究证实BLACAT1 能够靶向结合miR-20b-5p，抑制BLACAT1表达可能通过上调miR-20b-5p 表达从而促进宫颈癌细胞自噬进而增强细胞顺铂敏感性。
综上所述，BLACAT1与miR-20b-5p可参与宫颈癌细胞的顺铂耐药性过程，抑制BLACAT1表达可能通过上调miR-20b-5p 表达而增强宫颈癌细胞自噬活性从而提高细胞的顺铂敏感性，可为宫颈癌的治疗提供潜在靶点。
