维生素D受体对心肌缺血再灌注损伤的影响及作用机制

杨永秀，赵锋

作者单位：1西安高新医院内科，陕西 西安710075；2陕西省友谊医院内科，陕西 西安710068

心肌缺血再灌注损伤是导致急性心肌梗死病人预后不良的关键性因素之一，在临床实践中，寻找有效的心肌保护药物靶点一直是研究的热点。维生素D 受体[Vitamin D（1，25-dihydroxyvitamin D3）receptor，VDR］是配体依赖的核受体超家族成员，具有典型的核受体分子结构，在具体分子机制中，配合结合结构域是维生素D 或合成激动剂的结合部位，也是参与形成VDR/RXR（retinoid X receptor，RXR）异源二聚体的重要部位。根据相关研究，VDR 主要在肠道以及肾脏组织内存在高表达现象，对于钙磷代谢的调节发挥作用。近年来，随着研究的深入，VDR在内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞等多处均有表达，对于血管生理病理功能的发挥具有重要作用。具体到心肌组织，对VDR激活，对于心肌肥大的抑制以及心肌重塑的改善具有重要价值。但是，其在心肌缺血再灌注损伤中的作用尚不明确，需要进一步研究。本研究将2018年12月至2019年1月期间选择的野生型C57BL/6小鼠作为研究对象构建小鼠心肌缺血再灌注损伤模型，探讨了VDR对心肌缺血再灌注损伤的影响及作用机制，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

2018年12月至2019年1月期间选择野生型雄性C57BL/6 小鼠60 只，8 周龄，体质量为（24.48±2.55）g，由武汉大学人民医院心血管病研究所SPF级实验动物中心（许可证号SYXK2009-0053）提供。

1.2 方法

按照随机数字表法分成四组，每组15只，构建小鼠心肌缺血再灌注损伤模型。将小鼠放置于已经连接好麻醉机的麻醉罐中，以浓度为2%的异氟烷进行吸入麻醉，确保麻醉充分后，取出小鼠，放置在手术板上，改为经口鼻麻醉，将四肢固定后，用75%乙醇消毒前胸皮肤，在胸骨左缘第四肋间作长度为1 cm 的纵向切口，将皮肤切开后，将胸大肌和胸小肌分离，将第四肋间暴露出来，用蚊式止血钳切开后，撑开肋骨，在胸廓两侧挤压，将心脏经由第四肋间滑出，找到左冠状动脉进行结扎，结扎位置为冠脉开口以下3 mm处，如果结扎以下部位心肌组织发白，则显示左前降支结扎成功，随后将心脏放回胸腔，用手挤压，排出胸腔内气体，在切口处进行荷包缝合。在缝合过程中，将活结缝线一端剩余约0.5 cm至于体外，术后将小鼠放回饲养笼内，常规饲养，于3～5 min 后自行苏醒，左前降支结扎30 min 后，再次对小鼠进行异氟烷（2%）麻醉，随后提拉结扎左前降支缝线，解开活结，记录再灌注开始时间。假手术组小鼠采用同样的麻醉和手术方案，但只在左前降支血管下方穿线，并不结扎血管。给予药物干预实验，分为假手术组、对照（Vehicle）组、VDR 生理性激动剂Calcitriol组（Calcitriol组）和特异性合成激动剂PC 组（PC 组），给予Vehicle 组腹腔内注射Vehicle，于再灌注前15 min 给药，给予Calcitriol 组腹腔内注射VDR 生理性激动剂Calcitriol 1 μg/kg，于再灌注前15 min 给药，给予PC 组腹腔内注射特异性合成激动剂PC，注射剂量为1 μg/kg，于再灌注前15 min 腹腔内给药。采用缺血30 min+再灌注24 h 的方法，在再灌注24 h 后，对小鼠血流动力学、心肌梗死面积以及心功能进行测定。

1.3 观察指标

对比四组小鼠再灌注24 h 后血流动力学指标、心肌梗死面积、心功能情况。心肌梗死面积的测定，首先对小鼠心脏进行伊文氏蓝溶液染色并保存在-80 ℃环境中待测，取出心脏后，放置在滤纸上，摘除心房和主动脉根部组织，从心尖到心底，用手术刀将心脏平均切成5片，并用滤纸将伊文氏蓝溶液吸收，将心脏切片放置与1% 红四氮唑溶液（triphenyltetrazolium chloride，TTC）的24 板孔中，37 ℃恒温水浴箱中孵育10 min，随后将心脏切片取出，将心脏切片压平后，放置于培养皿中，按照既定的顺序进行排列，用相机拍照。借助SigmaScan Pro 5.0 软件对图片进行处理，计算没有被TTC染色的白色区域、被TTC 染色的红色区域和没有被TTC染色的白色区域之和以及被伊文氏蓝溶液染色的蓝色区域，白色区域代表心肌梗死区域、蓝色区域代表非缺血区域，红色和非白色区域为缺血区域，通过计算获取心肌梗死范围，公式为心肌梗死范围=梗死区域/缺血区域×100%。

在再灌注24 h 后，随机选择小鼠进行心脏超声检查，在对心前区鼠毛脱毛后，对小鼠进行2%异氟烷持续吸入麻醉，取仰卧位固定在超声检查台上，采用VisualSonics 公司的VEVo 超声诊断仪进行测定，设定探头频率为30 MHz，采集胸骨旁左心室长轴切面、心尖四腔切面的心脏超声图像，测定心率，记录心电图变化，测量左心室射血分数（Left ventricular ejection fractions，LVEF）和缩短分数（Left ventricular fractional shortening，LVFS），各组小鼠的心脏超声图像采集均由同一人完成。

在再灌注24 h 后，对小鼠行小动物Micro-PET/CT检测，根据小鼠体质量，给予2%异氟烷麻醉后，经尾静注射10 MBq 18F-FDG，在注射90 min 后，取俯卧位，利用Siemens INveon Micro-PET/CT设备对其进行扫描显像，设备分辨率为1.5 mm，单个床位孔径为5.7 cm，轴向8.5 cm 视野，利用Inveon Acquisition Workplace，设定电压为80 kV，电流为500 μA，曝光时间为1 100 ms，给予10 min 的CT 扫描，随后进行PET数据采集，并对冠状面、横断面、矢状面断层图像进行重建和处理，获取3D感兴趣区的18F-FDG平均标准摄取值（standardized uptake values，SUV）。

采用Softron 鼠尾测压系统对小鼠平均动脉压（MBP）和心率进行测定。

2 结果

2.1 VDR 激动剂对小鼠心肌缺血相关范围以及梗死面积的影响

如图1 和表1 所示，各组小鼠缺血相关范围差异无统计学意义，在再灌注前，给予小鼠Calcitriol或PC的小鼠，前者的梗死面积所占比例为（23.11±3.41）%，后 者 的 梗 死 面 积 所 占 比 例（26.72±2.67）%，而Vehicle 组小鼠梗死面积所占比例高达（44.22±3.12）%，可见Calcitriol 组和PC 组小鼠的心肌梗死面积明显小于Vehicle 组，经检验，均

P

＜0.05，可见激活VDR 能够有效减轻心肌组织缺血再灌注损伤，缩小心肌梗死的面积。

图1 利用Siemens INveon Micro-PET/CT扫描显示小鼠心肌缺血再灌注后心肌缺血相关范围以及梗死面积图：A为假手术组；B为对照组；C为PC组；D为Calcitriol组

表1 60只小鼠不同组别缺血相关范围和心肌梗死界面积比较/（%，±s）

2.2 VDR激动剂对小鼠心肌缺血再灌注后心功能的影响

组间比较显示，SUV、LVEF、LVFS存在明显差异（

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＜0.05），VDR激动剂对小鼠心肌缺血再灌注后心功能存在明显的影响。与假手术组相比，再灌注24 h后的Vehicle组小鼠的心肌摄取18F-FDG的SUV值为（1.11±0.49），显著降低，说明Vehicle组小鼠中有活力的心肌细胞数量明显减少，是由于缺血再灌注所导致有活力的细胞减少。而在Calcitriol组中，小鼠心肌摄取18F-FDG的SUV值为（2.23±0.91），在PC组中，小鼠心肌摄取18F-FDG的SUV值为（2.25±0.34），其SUV值明显较Vehicle组高，充分说明，激活VDR增加了有活力心肌细胞的数量。同时，根据超声心动图的检查结果显示，在再灌注前，给予Calcitriol或PC注射的小鼠，左心室收缩功能明显改善，Calcitriol 组的LVEF 为（64.11±1.52）%，LVFS 为（33.45±1.21）%，PC组小鼠的LVEF值为（59.13±2.31）%，LVFS值为（30.87±1.42）%，显著高于Vehicle 组，可见激活VDR能够提升左心室水平，改善心肌功能。见表2。

表2 60只小鼠VDR激动剂对小鼠心肌缺血再灌注后心功能的影响/±s

2.3 VDR 激动剂对小鼠心肌缺血再灌注后血流动力学的影响

在观察缺血再灌注的过程中激活VDR 对小鼠心肌缺血再灌注后的血流动力学无明显差别（均

P

＞0.05），见表3。

表3 60只小鼠VDR激动剂对小鼠心肌缺血再灌注后血流动力学的影响/±s

3 讨论

VDR隶属于核受体超家族，在肠道以及肾脏中有较高的表达。但是，除此之外，在其他组织内也有不同水平的表达。相关研究发现，VDR表达水平会在心肌缺血再灌注后显著升高，另外，也有研究发现，在心肌肥大模型中，VDR的表达水平在再灌注后也会出现上调，并通过内皮素或异丙肾上腺素进行诱导完成。可见，用VDR激动剂激活VDR后，能够有效抑制心肌肥大问题，说明对于心肌肥大病人而言，VDR是一种防御性保护因子。其对于心肌组织的保护作用主要表现为：第一，在细胞方面，激活VDR能够有效减少心肌细胞的凋亡，保持细胞活性。第二，在心脏功能方面，激活VDR 能够有效改善存活心肌的代谢能力，提升左心室泵血功能。第三，在整体心脏组织水平方面，激活VDR能够有效减少心肌梗死的面积。艾思迪等为了探讨心肌缺血再灌注诱导的VDR表达上调的生物学意义，采用药理学方法将VDR激活，观察其对心肌缺血再灌注损伤的影响。本研究就是以此作为灵感，以Calcitriol和PC开展实验。Calcitriol是维生素D代谢后的主要活性形式，属于维生素D受体的生理性激动剂。PC是维生素D受体的人工合成激动剂，由于其对肠道组织维生素D 受体的作用不大，因此，对于钙磷代谢的影响也较少，分别选择两者进行干预实验，能够有效避免维生素D受体激动剂的非特异效应所产生的干扰。

本研究发现，维生素D 受体生理性激动剂Calcitriol和人工合成激动剂PC均可以有效减轻心肌缺血再灌注的损伤问题。首先，在梗死面积方面，Calcitriol 组和PC 组小鼠的心肌梗死面积明显小于Vehicle组，经检验，均

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＜0.05，可见激活VDR能够有效减轻心肌组织缺血再灌注损伤，缩小心肌梗死的面积。其次，VDR 激动剂的应用会有效改善小鼠心肌缺血再灌注后的心功能指标。再灌注24 h后，Vehicle组小鼠中有活力的心肌细胞数量明显减少，是由于缺血再灌注所导致有活力的细胞减少的影响。而在Calcitriol 组小鼠心肌摄取18F-FDG 和PC 组小鼠心肌摄取18F-FDG的SUV值明显较Vehicle组高，充分说明，激活VDR 增加了有活力心肌细胞的数量，保证了心肌功能。同时，根据超声心动图的检查结果显示，Calcitriol 组和PC 组左心室收缩功能明显改善，其LVEF、LVFS 值均显著高于Vehicle 组，可见激活VDR 能够提升左心室水平，改善心肌功能。熊洋洋等通过研究发现，维生素D 受体能够有效抑制心肌肥厚问题，保护心肌功能，另有学者在研究中发现，VDR 激动剂之所以能够发挥对心肌保护效应，主要是通过抑制内皮素诱导的新生大鼠心肌细胞的肥大反应实现。李瑾等研究指出，在小鼠心肌梗死后慢性心力衰竭模型中，PC的应用，能够有效抑制心肌重塑问题，改善心功能。宁云芳等在研究中发现，激活VDR 能够有效减轻急性心肌缺血再灌注损伤，对于调节心肌急性应激反应具有重要作用，可见VDR 对心肌的保护效应十分强大。另有研究发现，维生素D 受体能够有效减轻冠心病严重程度，对于冠心病的临床干预意义重大。

VDR 激动剂除了可以直接对心肌VDR 发挥作用形成对心肌的保护以外，同时，对心肌功的保护还体现在对调节血压方面。但是，不同学者关于此方面的研究，得出的结论并不一致。根据Diez 等的观点，在血管紧张素Ⅱ诱导的小鼠心肌肥厚模型中，给予腹腔注射300 ng/kg PC，隔天注射1次，在连续注射14 d 后，血管紧张素Ⅱ引起的收缩压升高问题得到抑制，而舒张压的变化并不明显。Diez指出，在高盐饮食诱导的Dah1 盐敏感大鼠（Dahl salt-sensitive rats，DS大鼠）心肌肥厚模型中，通过给予200 ng/次PC 腹腔注射6 周（3 次/周）后，大鼠的血压和心率没有明显变化。但是，本研究发现，针对小鼠心肌缺血再灌注模型，给予Calcitriol 或PC 注射后，对再灌注24 h的心率和血压均无明显的影响，说明VDR 激动剂发挥对心肌的保护作用并非通过血流动力学。

综上，通过药理学方法激活VDR 能够有效减轻心肌缺血再灌注损伤，可以作为治疗缺血性心脏病的新的干预靶点进行深入探讨。由于本研究受到研究对象等因素的影响，对于VDR 受体激动剂对心肌的保护作用机制研究不够深入，同时，本研究局限在动物实验方面，在细胞学分子水平以及临床验证方面的研究，仍然任重而道远。