敲低Ⅰ型胶原α1链基因抑制鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭的研究

马永红，同娟

作者单位：宝鸡市中心医院耳鼻喉科，陕西 宝鸡721000

鼻咽癌是一种发病率较高的常见头颈部肿瘤，其死亡率居于头颈部恶性肿瘤的前列。在我国，南方鼻咽癌的发病率高于北方，每年新增病人占全世界鼻咽癌新增病例的一半以上。鼻咽癌具有发病隐匿、转移性强等临床特点。目前，临床常采用放化疗结合治疗鼻咽癌，但由于病人的放化疗抵抗性极大限制了治疗效果，严重影响鼻咽癌病人的5年生存率。近年来，发现分子靶向治疗具有特异性强、副作用小等特点，成为临床探究鼻咽癌治疗的重点。近年来的研究证实，属于胶原蛋白家族的Ⅰ型胶原α1 链（COL1A1）基因在乳腺癌、结肠癌等多种肿瘤组织中表达量显著增加，下调COL1A1抑制细胞的增殖，促进细胞的凋亡，表明在肿瘤的病理演进过程中其发挥促进作用。但COL1A1在鼻咽癌中的作用尚不十分清楚，因此2017年9月至2018年12月，本研究通过小干扰RNA（Small interference RNA）下调鼻咽癌细胞中COL1A1的表达量，研究其对鼻咽癌细胞生物学特性的影响，为鼻咽癌的临床治疗提供分子靶位点。

1 材料与方法

1.1 实验材料

鼻咽癌各细胞系（C666-1、CNE1、CNE2）以及人鼻咽上皮细胞（NP69）均购自北纳生物，DMEM培养基、胎牛血清、Lipofectamine 2000、RNA试剂提取试剂盒购自美国Thermo公司，反转录试剂盒、实时定量PCR（qPCR）购自美国Sigma公司，噻唑蓝（MTT）购自美国Bio Basic Inc公司；siRNA COL1A1以及阴性对照购自上海吉玛公司，COL1A1抗体、钙黏蛋白E（E-cadherin）抗体、波形蛋白（Vimentin）抗体、钙黏蛋白N（N-cadherin）抗体购自美国Sigma公司。酶标仪、qPCR仪购自美国Thermo公司。

1.2 细胞的培养

鼻咽癌各细胞系（C666-1、CNE1、CNE2）培养于含10%胎牛血清DMEM培养基，5%二氧化碳、37 ℃培养箱孵育，每2～3 天加入胰酶消化、传代。

1.3 细胞的转染

选取生长良好的CNE1细胞，随机分为对照组（常规培养）、si-NC组（转染阴性对照）、si-COL1A1组（转染siRNA COL1A1）。在Lipofectamine 2000说明书指示将转染质粒和Lipofectamine 2000分别进行稀释、混合，加入每孔细胞中培养4～6 h，更换培养基，置于5%二氧化碳、37 ℃培养箱中继续培养。

1.4 qPCR实验

采用RNA提取试剂盒提取各组细胞中总RNA，在反转录试剂盒说明书指示下合成cDNA。以鼠抗人三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）为内参，进行qPCR实验，反应条件为95 ℃5 min，95 ℃30 s，62 ℃30 s，72 ℃1 min，35个循环，72 ℃10 min，目的基因的表达量采用2法进行计算。其中，COL1A1引物（正向引物为5，-GTTGTGCGATGACGTGATCTGT-3， ，反向引物为5，-TTGGTCGGTGGGTGACTCTG-3，）以及GAPDH 引物（正向引物为5，-CTG GGCTAC ACTGAGCACC-3，，反向引物为5，-AAG TGG TCG TTG AGGGCA ATG-3，）由上海生工合成。实验重复3次。

1.5 MTT 实验

收集各组CNE1 细胞，将5×10个CNE1细胞接种至96孔板，分别培养24 h、48 h、72 h，每孔CNE1细胞中加入20 μL MTT，37 ℃孵育4 h，每孔CNE1细胞中加入150 μL二甲基亚砜（DMSO），振荡10 min，酶标仪检测490 nm吸光值，记为A值。

1.6 Transwell实验

在侵袭实验前，Transwell上室膜中提前覆盖Matrigel胶稀释液，而迁移实验无须此过程。收集各组CNE1细胞，将5×10个CNE1细胞加入Transwell上室，将600 μL含15%胎牛血清的培养基加入下室，培养24 h；PBS清洗、弃去残留细胞，甲醛固定、结晶紫染色各30 min，显微镜取5个区域拍照、计数，取平均值。

1.7 蛋白质印迹法（Western blotting）

收集各组CNE1细胞，RIAP裂解液提取CNE1细胞总蛋白，10%SDS-PAGE 凝胶为介质，进行电泳，挑选目的条带转移至PVDF膜。置于5%封闭液孵育2 h，TBST清洗3次，加入COL1A1（1∶200）、E-cadherin一抗（1∶5 000）、Vimentin 一抗（1∶5 000）、N-cadherin 一抗（1∶2 000）、GAPDH一抗（1∶10 000），辣根过氧化物酶标记二抗（1∶1 000）孵育，加入ECL发光液，曝光、显影、定影，检测目的蛋白灰度值/GAPDH蛋白灰度值。

2 结果

2.1 COL1A1在细胞系中的表达量

与人鼻咽上皮细胞（NP69）相比，COL1A1 mRNA和蛋白表达量在鼻咽癌各细胞系（C666-1、CNE1、CNE2）中表达量增加（

P

＜0.05），其中在CNE1细胞中的表达量最高。结果如表1、图1所示，

表1 各组细胞中COL1A1的表达量/±s

图1 各组细胞中COL1A1蛋白的表达量

2.2 转染siRNA COL1A1 对细胞中COL1A1 表达量的影响及敲低COL1A1 对CNE1 细胞增殖的影响

将siRNA COL1A1以及阴性对照转染入CNE1细胞系中，从而敲低COL1A1的表达量，与对照组相比，COL1A1在si-NC组细胞中表达量变化差异无统计学意义，但在si-COL1A1 组细胞中表达量下降（

P

＜0.05）。与对照组相比，转染阴性CNE1细胞增殖活性差异无统计学意义，但敲低COL1A1 的表达量降低CNE1细胞增殖活性（

P

＜0.05）。见表2、图2。

图2 转染siRNA COL1A1对细胞中COL1A1蛋白表达量的影响

表2 转染siRNA COL1A1对细胞中COL1A1表达量的影响及敲低COL1A1对CNE1细胞增殖的影响/±s

2.3 敲低COL1A1 对CNE1 细胞迁移、侵袭及上皮细胞间充质化（EMT）相关蛋白水平的影响

与对照组相比，转染阴性对照的CNE1细胞侵袭、迁移细胞数无显著变化，但敲低COL1A1的表达量降低CNE1细胞侵袭、迁移数目（

P

＜0.05）。与对照组相比，转染阴性对照的CNE1 细胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 蛋白表达量差异无统计学意义，但敲低COL1A1的表达量增加E-cadherin蛋白水平、降低Ncadherin、Vimentin 蛋白水平，差异有统计学意义（

P

＜0.05）。见表3，图3。

表3 敲低COL1A1对CNE1细胞迁移、侵袭及EMT相关蛋白水平的影响/±s

图3 敲低COL1A1对CNE1细胞的影响：A为EMT相关蛋白水平的影响；B为迁移和侵袭的影响

3 讨论

肿瘤组织的形成过程是癌基因以及抑癌基因相互调控的过程。因此，探究肿瘤病理演进过程中的基因表达量变化对探究肿瘤发生发展机制具有重要的作用。COL1A1基因长约17 537 bp，位于人染色体17q21.33，包含51个外显子，编码Ⅰ型胶原纤维前体α 2 链，是细胞外基质的重要组成部分。研究发现，COL1A1在多种肿瘤组织中异常表达，参与肿瘤的发生发展。在乳腺癌中，COL1A1表达量异常，且与乳腺癌细胞增殖、迁移等过程有关，参与肿瘤的预后。在宫颈癌中，COL1A1 的表达量显著增加，敲低COL1A1的表达量可通过调节细胞的凋亡率进而影响其放疗敏感性，参与宫颈癌的放射治疗过程。分析显示，COL1A1在肝癌中表达量明显异常，是肝癌病人预后的潜在靶基因。另外，研究发现，COL1A1在前列腺癌、喉癌等多种肿瘤病理进展过程中发挥重要的调控作用。

为探究COL1A1在鼻咽癌中的调控作用，本研究通过qPCR检测发现，COL1A1在鼻咽癌细胞系C666-1、CNE1、CNE2中的表达量明显增加，表明COL1A1参与鼻咽癌的病理进程，其中在CNE1细胞中的表达量较高，因此作为后续研究对象。在Lipofectamine 2000介导下将siRNA COL1A1转染入CNE1细胞中，qPCR和Western blotting 检测转染效果，结果显示，siRNA COL1A1显著降低CNE1细胞中COL1A1 mRNA和蛋白的表达量，表明siRNA COL1A1 质粒可稳定下调COL1A1 的表达量。MTT 和Transwell 法检测敲低COL1A1 对细胞增殖、侵袭、迁移的影响，结果显示，COL1A1表达量降低抑制CNE1细胞增殖，降低其侵袭、迁移能力，表明COL1A1可通过调节鼻咽癌细胞的生物学特性，进而调控其肿瘤组织的生长。

肿瘤细胞的侵袭、迁移特性受多种基因、信号通路的调控，与肿瘤病人的预后紧密相关。研究表明，肿瘤组织发生转移的过程不仅与基因水平相关，还与上皮细胞转变形成间质细胞有关。在生理或病理状态下，EMT 的形成过程主要与上皮性标志物（Ecadherin）、间质性标志物（Vimentin、N-cadherin）的水平显著相关，在肿瘤发生发展、细胞迁移过程中发挥重要作用。为探究COL1A1调控CNE1细胞增殖、侵袭、迁移的作用机制，本实验通过Western blotting检测细胞中EMT相关蛋白的表达量，结果发现，敲低COL1A1的表达量促进E-cadherin蛋白表达，抑制Vimentin、N-cadherin蛋白表达，表明敲低COL1A1可通过抑制EMT过程，从而影响细胞的增殖、侵袭、迁移。

综上所述，COL1A1在鼻咽癌细胞中的表达量增加；敲低COL1A1表达量抑制鼻咽癌CNE1细胞增殖、侵袭、迁移，可能通过影响EMT过程。本实验只在鼻咽癌CNE1细胞中探究了COL1A1的作用以及可能分子机制，未来会在鼻咽癌多株细胞系以及动物、临床样本中进一步探究COL1A1参与鼻咽癌发生发展的具体作用以及与相关信号通路的调控作用。