桑黄酮G对缺血性中风大鼠血脑屏障的保护作用

刘少静，腾军放，许玉明，李玉生，张杰文，马建军

作者单位：1安钢集团公司职工总医院神经内科，河南 安阳455000；2郑州大学第一附属医院神经内科，河南 郑州450000；3河南省人民医院神经内科，河南 郑州450000

缺血性中风又称作缺血性脑卒中，是最常见的一种脑卒中类型，其病理机制主要是由于颅内动脉管腔中血栓形成或栓子停留，血管出现狭窄和闭塞，造成相应供血区域血流降低、中断，导致脑组织缺血、缺氧甚至坏死，进而产生一系列的神经缺损症状。大脑缺血缺氧会引起一系列病变，比如神经系统缺血缺氧性坏死、脑水肿、炎症反应、氧化应激反应等，并表现出感觉和运动功能受损的神经功能缺损症状，重症者意识丧失，是病人致残、致死的主要原因。血脑屏障（BBB）是维持中枢神经系统微环境动态稳定的重要结构，主要由星形胶质细胞、内皮细胞（endothelial cells，ECs）、周细胞、细胞外连续的基底膜和细胞外基质及神经元构成神经血管单元。BBB选择性通透结构受多种因素的共同调节，细胞间连续紧密连接（tight juctions，TJs）是保证BBB选择性通透的重要结构之一，TJs中最主要的蛋白有胞质紧密黏连蛋白-1（zonula occludens-1，ZO-1）、闭合蛋白（occludin）、紧密连接蛋白（claudin-5），其表达和分布与BBB的结构完整性密切相关，当发生缺血性中风时TJs表达明显减少，TJs 结构松弛，BBB 完整性破坏；基质金属蛋白9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）的激活使得基底膜降解，屏障结构进一步遭到损伤，这些蛋白的表达不仅与缺血性中风BBB结构密切相关，还参与多种退行性疾病的发生和发展。

桑黄酮G（kuwanon G，KG）是传统中药桑白皮的主要黄酮类化合物之一，已有研究表明，KG 可对抗口腔病原体的活性；Jung等发现KG 可以抑制卵白蛋白（ovalbumin，OVA）诱发的哮喘过敏小鼠模型中炎性细胞的浸润并减少促炎细胞因子的分泌；KG 具有中值有效浓度（EC 50）（0.8±0.04）mg/L 和中位致死浓度（LC 50）（38.0±0.82）mg/L，可以安全、有效地控制鱼鳞病。近期有研究发现运用人上皮结肠直肠腺癌（Caco-2）细胞构建体外肠道上皮屏障模型，探索KG 对LPS 诱导的上皮屏障的保护作用，发现KG 能够抑制炎性因子（IL-1β 和TNF-α）的分泌，抗氧化应激作用，上调细胞连接蛋白ZO-1、Occludin和细胞间黏附分子（ICAM-1）的表达，同时升高内皮电 阻 值（Transendothelial electrical resistance，TEER），对肠道屏障有明显的保护作用。本研究于2018年10月至2019年9月进行，运用大脑中动脉阻塞模型探讨桑黄酮G对缺血性中风大鼠脑水肿及BBB 的影响，探索作用机制，为桑黄酮G 治疗缺血性中风提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

45 只成年雄性健康的SD 大鼠，体质量范围250～300 g，购自昆明国家生物产业基地实验动物中心，许可证号SCXK（云）2018-0033。饲养室温度（22±2）℃，相对湿度（50±10）%，自由进食和饮水，所有实验动物均在相同条件下饲养，本研究符合一般动物实验伦理学原则。

1.2 试剂和仪器

桑黄酮G 购自北京百灵威科技公司。zo-1 兔抗（Thermo）、VE-cadherin 兔抗（Abcam）、Occludin 兔抗（Abcam）、Claudin-5 兔抗（Abcam）、MMP-9 兔抗（Abcam）、β-actin 兔抗（Abcam）、Western Blot 一抗和二抗稀释液（碧云天）、羊抗鼠DyLinght800荧光二抗（Thermo）、蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）（碧云天）、RIPA蛋白提取试剂盒（碧云天）、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量试剂盒（碧云天）、5×SDS 蛋白上样缓冲液（碧云天）、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（碧云天）、30%丙烯酰胺（Bio-Rad）、APS（Acros）、1.5M Tri-HCL（pH 6.8、8.8，上海双螺旋）、蛋白分子量marker（Bio-Rad）、BSA（USA）、PVDF 膜（Bio-Rad）、MCAo 栓线（A4 级，北京西农科技有限公司）、SDS-PAGE 凝胶电泳转膜装置（Bio-Rad）、双信道红外线激光成像系统（Odyssey，Li-COR）。

1.3 动物分组与处理

采用随机数字表法将45 只SD 成年雄性大鼠分为假手术组、模型组（MCAo）和治疗组（KG），每组15 只。其中假手术组大鼠按模型分离血管后缝合，模型组和治疗组大鼠建立大脑中动脉阻塞模型，治疗组大鼠在手术前每日1 次定时灌服5 mg/kg的KG 预处理，连续灌服3 d，假手术组和模型组大鼠给予同体积的无菌水。术前禁食禁水8 h，术后继续按术前灌服7 d后取材。

1.4 MCAo 模型的制备

根据Longa 等改良后的线栓法阻塞大脑中动脉模型制备本研究MCAo模型。剔除大鼠颈部皮肤备皮，75%的酒精棉球消毒备皮区域皮肤，用眼科剪于颈部正中间的位置做长约0.5 cm左右纵向切口，逐层剪开，分离出右侧颈总动脉（CCA）、颈内动脉（ICA）和颈外动脉（ECA），分离开与血管相并行的神经及筋膜，并挂线备用。结扎CCA和ECA近心端，显微剪在CCA近血管分叉口处剪一小缺口，将栓线由缺口处向ECA方向缓慢插入大脑中动脉（MCA）起始段，栓线标记长度到达CCA 与ICA、ECA分叉处时结扎ECA并固定栓线，清理切口处，逐层缝合。术后采用置于安静空间单笼饲养，自由进食。

1.5 神经功能缺损评分

各组大鼠术后6 h、1 d、3 d、7 d 分别采用改良神经功能缺损程度评分（modified Neurological Severity Scores，mNSS）神经功能评分法评估神经功能缺损，总分为18 分，分数越高神经功能缺损越严重，0～7分均认为无缺损症状。

1.6 脑含水量测定

术后1 d、2 d、3 d、7 d，每组分别取3 只实验大鼠，予以1%戊巴比妥钠（4 mL/kg）腹腔麻醉，迅速分离取出大鼠全脑，称量全脑组织湿重，随后放入烘箱100 ℃，48 h 后称量脑组织重量，即为干重，计算大脑含水量：含水量（%）=（湿重－干重）/湿重×100%。

1.7 蛋白质印迹法（western blotting）检测大鼠脑组织中BBB相关蛋白的表达

每组分别选取3只大鼠，使用1%戊巴比妥钠（4 mL/kg）腹腔麻醉，开胸充分暴露胸腔及心脏，将灌注针插入左心房并固定针头，剪开右心耳，缓慢推注预冷的生理盐水200 mL；小心剖开颅骨取出大脑，分离梗死侧大脑组织，移入制冷的EP管中，剪成组织碎片，称重，按（100 mg 组织样品）/（200 μL 含0.01 mol/L PMSF的RIPA裂解液）比列进行，利用匀浆机裂解样品，冰上操作，12 000 r/min，4 ℃15 min，收集离心所后得的将上清液即为所提取的总蛋白，根据BCA蛋白定量试剂盒测进行定量计算后稀释样品，加上样缓冲液，煮沸10 min。每个样品取30 μg蛋白上样，同时在两边孔分别加入5 μL、2 μL Marker进行电泳，结束后采用湿转2 h至PVDF膜上，脱脂奶粉室温封闭1 h，根据分子量大小及Marker的位置切膜，分别加入MMP-9单克隆抗体（1∶1 000）、ZO-1单克隆抗体（1∶1 000）、Claudin-5单克隆抗体（1∶1 000）、Occludin 单克隆抗体（1∶5 000）和β-actin单克隆抗体（1∶5 000），4 ℃摇床孵育过夜，TBST洗膜每5分钟3次，避光加入羊抗鼠DyLinght800荧光二抗（1∶5 000），室温避光孵育2 h，TBST 洗膜每5 分钟3 次，使用Odyssey进行暗室发光得到条带，使用Image J进行定量分析。

2 结果

2.1 KG 能显著改善缺血性中风大鼠神经功能缺损

MCAo 模型制备后6 h、1 d、3 d、7 d，分别进行神经功能缺损评分检测。mNSS 评分（

F

=22.37，

P

＜0.001）、时间（

F

=28.31，

P

＜0.001）及二者共同（

F

=15.73，

P

＜0.001）。结果发现，与假手术相比，模型组大鼠结果发现，与假手术组相比，模型组大鼠神经功能评分显著升高，出现缺损表现，主要有感觉功能障碍、平衡能力下降、偏瘫甚至无自主运动等中风表现。但是经过KG 治疗后，1 d 能明显改善缺损（

P

＜0.01），3 d、7 d改善更为明显（

P

＜0.001）。见表1。

表1 各组大鼠神经功能评分统计/±s

2.2 KG能明显减轻缺血性中风大鼠脑水肿

分别测量各组大鼠术后1 d、2 d、3 d、7 d，脑含水量（

F

=3.079，

P

＜0.05）、时间（

F

=143.6，

P

＜0.001）及二者共同（

F

=1.847，

P

＞0.05）。与假手术组相比，模型组大鼠大脑含水量增加（

P

＜0.001），且于2 d时脑水肿最为明显；而经KG治疗后，大脑含水量明显下降（

P

＜0.001），说明KG可以显著缓解缺血性中风大鼠脑水肿。见表2。

表2 各组大鼠脑含水量统计/±s

2.3 KG 能显著上调ZO

-

1、Occludin 和Claudin

-

5的表达及下调MMP

-

9 的表达

造模后7 d 如方法所述运用Western blotting 检测紧密连接蛋白ZO-1、Occludin 和Claudin-5 及基质金属蛋白MMP-9 的表达。如图1 及表3 所示，与假手术组相比，模型组紧密连接蛋白的表达明显减少（

P

＜0.001），MMP-9 表达显著升高（

P

＜0.001），而予以KG 治疗后，紧密连接蛋白的表达显著上调（

P

＜0.001），MMP-9 的表达显著下调（

P

＜0.001）。结果表明KG 可通过上调ZO-1、Occludin 和Claudin-5 的表达，下调MMP-9 的表达减少基底膜的损伤，从而保护BBB完整性。

图1 各组大鼠紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-5及基质金属蛋白MMP-9的表达

3 讨论

桑白皮作为传统常用中药材，具有泻肺平喘，行水消肿的功效，具有抗氧化应激、降血糖、抗癌、抗炎、保护肠屏障等作用。临床上常用于治疗水肿、咳嗽、糖尿病、气管炎等疾病。然而对于缺血性中风的治疗尚不明确，但研究已经表明对于肠道屏障完整性有一定的保护作用，那么设想可能对BBB也具有一定的保护作用，对脑水肿可能有调节作用。

BBB 是存在于血液循环与大脑内环境之间的严格的、动态的、选择性的物理屏障，通常血液中的小分子物质（如：水、氧气、葡萄糖、二氧化碳、氨基酸等）及有益物质能正常透过BBB，而大分子物质及有害物质（如外来药物、氢离子、胆盐及非脂溶性物质）几乎不会通过BBB。中枢神经系统疾病及退行性疾病，如中风、脑外伤、阿尔海默兹病、帕金森等均会导致BBB的完整性破坏，引发生脑水肿、炎症等，神经系统失去保护屏障，引发一系列的神经功能缺损症状。在本研究中，我们运用大鼠大脑中动脉阻塞模型，给予KG治疗。结果显示，MCAo大鼠神经功能明显缺损，而予以KG治疗后神经功能缺损状况明显得到改善；MCAo大鼠脑含水量增加，且术后2 d脑水肿最为严重，说明MCAo大鼠的确存在着脑水肿；而给予KG治疗后，MCAo大鼠大脑含水量显著下降，由此可见，KG可显著减轻脑水肿。脑微血管内皮细胞之间广泛的TJs作为维持BBB的完整性的主要结构，其紧密状态及TJs蛋白的表达与BBB密切相关，ZO-1、occludin 和claudin-5是构成TJs 的重要分子蛋白，同时BBB结构的维持还有赖于基底膜的完整性，MMP-9表达减少有助于维持基底膜结构，这些分子的表达异常会导致TJs松弛及BBB的结构改变，缺血缺氧等变化常会导致ZO-1、Occludin 和Claudin-5的表达下降，这些分子的异常表达会严重破坏TJs结构，MMP-9的表达升高使基底膜的稳定破坏，会进一步加重BBB的损伤。而升高维持这些分子正常表达，能够有效保护BBB，避免有害物质透过BBB进入大脑组织，损伤脑组织及大脑微环境。在本研究中，我们检测到在MCAo模型大鼠脑组织中ZO-1、Occludin 和Claudin-5表达明显下调，MMP-9表达明显升高。而经过KG治疗的MCAo大鼠，脑组织中ZO-1、Occludin 和Claudin-5表达明显上调，MMP-9表达明显抑制，这就提示KG能够显著上调Claudin-5、Occludin 和ZO-1 的表达水平，维持BBB 紧密连接，同时抑制MMP-9表达，减少基底膜的降解，进一步维持BBB结构的完整性。

表3 各组大鼠紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-5及基质金属蛋白MMP-9的表达/±s

总之，我们的研究结果表明MCAo 模型大鼠神经功能明显损伤、脑水肿严重，其机制可能与紧密连接松弛，基底膜损伤，BBB完整性破坏有关；KG治疗后明显恢复了大鼠的神经功能，KG 发挥神经保护作用的机制可能是通过提高紧密连接蛋白Claudin-5、Occludin 和ZO-1 的表达，同时抑制MMP-9 激活，恢复紧密连接状态及基底膜结构，维持BBB 完整性有关。我们的研究初步解释了KG 脑保护的机制是通过对BBB 完整性的保护实现的，对于KG 其他的脑保护分子机制进一步深入研究，将有利于更好的开发和利用KG这一传统中药活性成分。