肝癌细胞中丛生蛋白的差异性表达检测和启动子表达质粒的构建

于秋丽，王 峰

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的肝脏恶性肿瘤[1]，肝癌的发生发展是环境、病毒、癌基因激活和抑癌基因突变等多种因素共同作用的结果。目前其治疗以手术、介入治疗、分子靶向治疗以及全身系统化疗等多种治疗手段联合应用为主。由于肝癌发病早期缺乏典型特征和特异性生物标志物，多数患者确诊时已处于中晚期，失去了最佳的治疗时机，以致肝癌是所有癌症相关死亡的第三大死亡原因[2]。阐明肝癌发生、发展和转移的分子基础，找到用于肝癌早期检测和分子靶点的生物标志物，将为肝癌的早期诊断和治疗提供新的视角。丛生蛋白(clusterin，CLU)是一种应激诱导的细胞保护伴侣蛋白，在多种癌症中过表达，以应对化疗、激素消融术和放射治疗等癌症治疗方法，从而产生抵抗性[3,4]。为探究HCC中CLU的表达，Kang等[5]用组织微阵列方法检查了100例手术切除的HCC组织，发现共有89例HCC组织表现出CLU过表达，这与肿瘤不良的Edmondson组织学分级和高TNM分期有关。另一项研究[4]表明CLU过表达是肝癌转移的重要因素，这可能与人类软骨糖蛋白-39在HCC中的转移作用有关。鉴于CLU在肝癌的发生、发展中的重要作用，本研究对CLU在肝癌细胞HepG2中的表达情况进行定量并构建其启动子的表达质粒，以期对其在肝癌中的转录调控机制进行进一步的研究。

1 材料与方法

1.1细胞培养 肝癌细胞株HepG2和人正常肝细胞L02均是本实验室保存。上述细胞分别培养于含有10%胎牛血清(Gibco公司)的DMEM高糖培养基(Gibco公司)和含有10%胎牛血清的1640培养基(Gibco公司)培养液中。培养箱条件设置为37 ℃、5% CO2。待细胞汇合度达到85%以上时用于后续研究实验。

1.2RNA的提取及实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)

严格按照TaKaRa试剂盒说明书的步骤进行L02细胞和HepG2细胞RNA的提取和逆转录，按照SYBR Master Mix试剂盒(Roche公司)说明书配制反应体系和设置反应条件，进行RT-qPCR检测。每个样本至少重复3次，计算平均Ct值，根据2-ΔΔCt计算相对表达量。CLU的引物序列：F：5′-CTACTTCTGGATGAATGGTGACC-3′；R：5′-CGGGTGAAGAACCTGTCCT-3′。内参GAPDH的引物序列：F：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′；R：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。

1.3CLU基因的启动子的分析 CLU基因的启动子序列通过冷泉港的转录因子数据库(http://rulai.cshl.edu/cgi-bin/TRED/tred.cgi?process=searchPromForm)分析获得，序列为-700～+300。该数据库以Genebank中的序列为基础。见表1。

表1 CLU基因启动子序列信息

1.4细胞基因组DNA的提取 按照TaKaRa试剂盒说明书进行肝癌细胞HepG2基因组DNA的提取。检测DNA的纯度为1.91(A260/A280)，符合要求。

1.5HepG2细胞CLU基因的启动子序列测序 提取的HepG2基因组送上海生工公司进行CLU基因启动子序列测序，并合成测序后的启动子序列。

1.6CLU基因启动子克隆质粒构建 合成测序后的启动子序列，并在启动子序列的两端加上酶切位点(XmaⅠ/XhoⅠ)序列，用2种限制性内切酶对pGL3-Basic质粒进行酶切，胶回收载体片段，然后通过连接反应将目的启动子序列插入到pGL3-Basic表达载体中，并转化到感受态大肠杆菌DH5α中，经筛选获得单克隆。

1.7质粒转化、提取及验证 将含有pGL3-CLU质粒的菌种接种到含有氨苄青霉素的(100 mg/L)LB液体培养基中，于37 ℃摇床中培养16 h。提取质粒后进行酶切(XmaⅠ/XhoⅠ限制性内切酶)，酶切后质粒通过琼脂糖凝胶电泳鉴定。提取的质粒进一步通过测序鉴定。

2 结果

2.1HepG2细胞和L02细胞的CLU mRNA表达水平比较 RT-qPCR检测结果显示，HepG2细胞CLU mRNA的表达水平显著高于L02细胞(t=20.670,P=0.002)。HepG2细胞CLU mRNA的相对表达量约是L02细胞的9.38倍。见图1。

图1 HepG2细胞和L02细胞的CLU mRNA表达水平比较图

2.2HepG2细胞CLU基因启动子测序结果与Genebank中的序列比对结果 测序比对结果显示，HepG2细胞的CLU基因启动子区序列与Genebank中的序列一致，未发现突变。见图2。

2.3pGL3-CLUP表达质粒的构建与鉴定 构建后的重组pGL3-CLUP质粒用XmaⅠ/XhoⅠ酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果显示pGL3-CLUP质粒在双酶切之后，出现两条片段，一条在5 000 bp附近，一条在1 000～1 500 bp处。经单酶切的原质粒pGL3-CLUP电泳条带在5 000～6 000 bp之间，提示表达启动子的重组质粒构建成功，见图3。pGL3-CLUP表达质粒图谱见图4。

图2 HepG2细胞CLU基因启动子测序结果与Genebank中的序列比对结果图

条带1为DNA ladder，条带2为经双酶切之后的pGL3-CLUP质粒，条带3为经单酶切的pGL3-CLUP质粒

图4 pGL3-CLUP质粒图谱

3 讨论

3.1肝癌的发生涉及癌基因及其产物的多个突变，这些突变通过多种信号转导途径调节肿瘤的发生与发展。由于缺乏有效的特异性生物标志物，早期肝癌的成功检测是一个挑战，以至于发现症状时多数患者已处于晚期。肝癌的传统治疗以化疗、肝脏切除、肝移植和射频消融为主，但疗效均不理想，导致肝癌患者的病死率较高[6]。早期诊断可为肝癌患者尽早接受有效治疗提供机会，改善预后。

3.2肝癌在发生发展过程中会差异性表达很多基因，这些基因在肝癌中的差异性表达大多受其启动子的调控，有些基因已被作为肝癌的差异性诊断标志物，还有一些基因参与了肝癌发生发展的关键环节。如本研究团队在此前的一项研究[7]中发现，钙调蛋白2(calponin 2，CNN2)在肝癌中高表达，并对肝癌的发生发展起着重要作用；而我们的另一项研究[8]还发现，蛋白衰老标记蛋白30(senescence marker protein 30，SMP30)在肝癌中特异性低表达，可作为肝癌的潜在预后指标。

3.3CLU基因是一个单拷贝基因，位于8p21-p12染色体上，由9个外显子、8个内含子和一个5′-未翻译区域构成，它编码人类的三种不同转录异型体[9]：亚型1，NM_001831，mRNA(GenBank)；亚型2，NR_038335，非编码RNA(GenBank)；亚型3，NR_045494，非编码RNA(GenBank)。GenBank数据库数据显示，亚型1编码功能蛋白，而亚型2和亚型3代表非编码RNA。在人类中，有两种由该基因编码的蛋白质：分泌型丛生蛋白(secretory clusterin，sCLU)(75～80 kda)和核CLU蛋白(55 kda)[10]。CLU基因首次在公羊睾丸网液中被检测到，随后在许多不同的组织中发现CLU基因的存在[11,12]。因此，在对该基因的研究之初，它有许多不同的名称，如SGP-2、SP40-40、TRPM-2和ApoJ。后来经过完整的cDNA克隆、测序和比较，证实SGP-2和TRPM-2与CLU完全相同，后来被正式命名为CLU[4]。

3.4热休克处理HepG2细胞可以诱导CLU mRNA表达，且这种热休克诱导在不同物种的培养细胞中都可以观察到。由于临床上可能存在热休克与细胞凋亡的关联，故CLU可能在细胞凋亡过程中起作用[13,14]。随着研究的深入，CLU被发现在许多人类肿瘤中表达，包括乳腺癌、肺癌、膀胱癌、肾癌和前列腺癌，且其表达与化疗药物的广泛耐受有关。

3.5sCLU是一种80 kda糖蛋白，几乎存在于所有体液中，对CLU基因的研究使人们对肿瘤耐药的全新机制有了新的认识。sCLU在多种不同的肝癌组织中表达水平存在差异，并可能促进HCC转移和参与HCC对化疗的抵抗。但sCLU在HCC组织中的表达与HCC患者临床病理参数之间的关系仍不清楚，未来需要收集更多的乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒感染的HCC患者的样本来研究[15]。越来越多的研究[16]表明，CLU基因在肝癌细胞中异常高表达，其有望成为HCC的一种新型生物标志物。然而CLU在肝癌组织和血清中表达的相关性还不是很清楚，如果能找到CLU在肝癌组织中的表达与血清中表达的关系，了解CLU在HCC耐药的机制和信号转导途径，对于解决HCC多药耐药问题及肝癌的个体化治疗具有重要意义[4]。

综上所述，肝癌细胞CLU基因的表达量明显高于正常肝细胞。pGL3-CLUP质粒的成功构建为后续研究CLU基因在肝癌发生发展中的机制奠定了基础。