砷污染对香蒲生长及根系分泌正构烷烃的影响

杜崇宣, 刘云根,2*, 王 妍,2, 包宁颖, 陈 天

(1. 西南林业大学生态与环境学院， 云南 昆明 650224； 2. 西南林业大学山地农村生态环境演变与污染治理重点实验室， 云南 昆明 650224)

砷(Arsenic，As)是一种具有强毒性的环境污染物[1]，随着社会经济和工农业的发展，As被广泛应用于冶金、含砷杀虫剂、除草剂、木材防腐剂和饲料添加剂等，过量的As释放到环境中，导致土壤和水体的As污染问题日益严重[2-3]。据统计，世界土壤中As浓度的平均值为6 mg·kg-1，我国为11.2 mg·kg-1[4]，约为世界平均值的2倍。土壤As污染具有隐蔽性、累积性、地域性、不可逆性和长期性等特点，As污染不仅影响土壤肥力、作物产量和品质，而且会通过食物链的“生物放大”作用对人体健康产生极大威胁。因此，如何减轻As污染问题成为了目前亟待解决的问题，必须加以重视。

面对日益严重的土壤As污染现象，绿色环保的植物修复(Phytoremediation)是目前研究最热门的环境修复技术之一。香蒲(TyphaangustifoliaL.)是一种广泛分布于我国的挺水植物，其根系发达且生长快速。有研究表明[5]，在100～150 mg·kg-1As污染生境中，香蒲的生长发育状态不仅没有受到抑制，反而优于正常生境，表明香蒲对As污染具有一定的耐受性。因此，香蒲对As具有良好的吸附效果，能有效减轻土壤As污染，可作为As污染修复区生态修复的目标植物[6]。低量的As可以刺激植物的生长，但是超过了一定浓度，As就会对植物的光合作用等生理生态指标产生不同程度的影响[7-9]，而根系分泌的有机化合物组成和含量的变化是植物响应环境胁迫最直接和最明显的反映。因此，探究As污染对植物根系分泌物的影响已越来越重要。

高等植物的表皮覆盖着一层由长链有机化合物组成的蜡质。蜡质具有多种功能，它可以为植物提供物理化学保护屏障、减少非气孔水分的损失、控制温度、提供光保护、增强抗霜冻能力以及对有害物(包括害虫、真菌和细菌)攻击的抵抗力[10]。作为植物蜡质重要组成部分之一的正构烷烃在自然界植物的叶、茎、花以及果实器官和组织的表面广泛存在[11]，毕博远等[12]就从不同种植年限紫花苜蓿的根系分泌物中提取出多种正构烷烃化合物。由于其性质稳定、难降解，且正构烷烃与对应的生物源前身有一定的结构联系或相关性[13]，从而常用作分子标志物来指示生态环境特征与物源关系[14]，而有关逆境胁迫对植物根系分泌正构烷烃的影响鲜有报道。本研究通过分析不同浓度As(50，150，600 mg·kg-1)污染对香蒲光合色素、鲜重和根系分泌物的影响，旨在明确香蒲在As污染生境中的生理适应性机制，从而为As污染土壤的改良提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试植物：以As耐受型植物——香蒲为试验材料，香蒲购自云南省昆明市富民县香蒲种植基地。

土壤：校园无污染红壤，试验所用的土壤基本性质如下表1所示：

表1 供试土壤的基本性质

1.2 试验方法

取回的土壤自然晾干、粉碎，过2 mm筛后备用。使用前，将土壤与有机复合肥按1∶2(v∶v)混合，用黑色聚乙烯塑胶桶(25 cm×32 cm)作为湿地模拟装置(共12个)，每桶装入15 kg干土。在供试土壤中进行加As处理，分别添加0(CK)，50(低)，150(中)和600(高) mg·kg-14个浓度(以Na2HAsO4·7H2O为As源，As浓度以纯As计)并搅匀，每个浓度3次重复，添加10 L无菌水保持淹水状态并标记出每个湿地装置的持水线高度，并将土壤置于常温、黑暗环境中老化1.5个月。

待土壤老化以后，每个湿地装置移栽4株生长一致，苗龄为1个月的香蒲幼苗，以盆为重复，定株培养60 d，培养时间为：2018年4月15日—6月15日。室内进行，自然光照，室温：20～25℃，湿度：60%～75%，期间每隔一个星期向各湿地装置中添加无菌水至持水线高度。

1.3 测定指标与方法

叶绿素：叶绿素含量的测定用分光光度法[15]。

生物量：将提取完根系分泌物的植物样品，先用自来水小心清洗植物叶片及根部，再用滤纸吸去植株表面水分后用剪刀将植物分成地上部分和地下部分，用电子称测定各部分鲜重。

根系分泌物：以盆为单位，将植物从土壤中小心取出，参考韦雪晶等[16]的方法：用去离子水冲洗根系4次，洗净根部的土壤颗粒后用20%的H2O2溶液浸泡10 min，用去离子水洗净根系后，将根系转致盛有300 mL 0.5 mmol·L-1CaCL2溶液中，并保证根部处于避光条件下收集根系分泌物12 h。收集完成后，将收集好的浸提液定容至300 mL，过0.45 μm微孔滤膜。取浸提液加入分液漏斗与二氯甲烷1∶1比例萃取3次，合并萃取液，取有机相到旋转蒸发仪浓缩蒸发，减压浓缩至干后用2 mL色谱纯二氯甲烷润洗溶解有机相并过0.45 μm有机滤膜后装入2 mL样品瓶-20℃保存备用。

GC-MS分析：采用电子轰击源，轰击电压70 eV，扫描范围M/Z30～600AMU，扫描速度0.2 s扫全程，离子源温度230℃。毛细管柱：HP-5MS柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，进样口温度250℃，柱温50℃(2 min)，以6℃·min-1程序升温至250℃(保持15 min)。载气为He，流量1 mL·min-1，进样量为l次。为消除试验误差，按照相同测定条件以萃取剂二氯甲烷作空白试验。应用NiST08质谱数据库，分析质谱图，确定各组分物质名称，采用外标法进行定量分析。

1.4 数据处理

采用SPSS 18.0和Microsoft Excel 2010软件对试验数据进行单因素方差和数据均值及标准差分析。

2 结果与分析

2.1 As污染对香蒲叶绿素含量和鲜重的影响

如表2所示，As污染对香蒲叶片光合色素含量的影响均表现出“低促高抑”的趋势，即低、中浓度As污染处理条件下，香蒲叶片光合色素含量增加。叶绿素a和总叶绿素含量在底泥As低浓度处理下，有所上升，但是变化幅度较小，分别较CK增加了1.14%和3.08%，而叶绿素b含量则显著升高(P<0.05)，较CK增加4.30%；叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量均在底泥中浓度污染时达到峰值，并显著高于CK(P<0.05)，分别较CK增加23.43%，17.56%和19.60%；高浓度As污染处理后叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量均降低，与CK相比，叶绿素a含量没有显著降低(1.14%)，叶绿素b和总叶绿素含量分别显著降低了48.74%和30.40%(P<0.05)。叶绿素a/b在底泥As中浓度污染时变化幅度较小，当底泥As低浓度污染时，叶绿素a/b显著低于CK(P<0.05)，高浓度污染时则显著高于CK(P<0.05)，这主要是与叶绿素a和叶绿素b的增加或降低幅度有关，并且高浓度As处理条件下叶绿素a的降解明显低于叶绿素b。

表2 As污染对植物光合色素的影响

由图1可知，底泥As污染对香蒲地上部鲜重与地下部鲜重的影响也均呈现出中低浓度促进、高浓度抑制的“低促高抑”规律。植物地上部分鲜重在底泥As低、中浓度污染处理条件下，均显著高于CK(P<0.05)，分别增加了26.20%和16.73%。植物地上部分鲜重在低浓度As处理达到峰值后便开始降低，中浓度As处理相对于低浓度植物地上部分有所降低，但差异不显著，高浓度As处理植物地上部分鲜重相对于低、中浓度显著降低(P<0.05)，并显著低于CK(P<0.05)，降低了44.26%。

植物地下部分鲜重在底泥As低、中浓度污染处理后同样也高于CK，低浓度As处理条件下，植物地下部分鲜重增加8.85%，而中浓度As处理则增加了136.42%(P<0.05)，高浓度As处理后地下部分显著降低(P<0.05)，相对于CK减少了38.41%。可见，低、中浓度As污染处理不仅没有抑制植物的生长发育，反而促进了植物的生长发育，而高浓度As污染处理则显著性抑制植物的生长发育。

图1 As污染下香蒲各部分生物量

2.2 As污染对香蒲根系分泌正构烷烃的影响

由表3可知，香蒲根系分泌的11种正构烷烃化合物浓度在底泥As污染处理后均呈现“先增后降”的趋势，即中低浓度增加，而高浓度降低。除二十三烷低浓度As污染处理显著低于CK外，其余化合物浓度均在底泥低、中和高浓度As污染处理后，正构烷烃化合物浓度均显著高于CK(P<0.05)；除十六烷高浓度As污染处理显著低于低浓度As污染处理外(P<0.05)，其余化合物浓度均在底泥中、高浓度处理条件下显著高于低浓度处理(P<0.05)；除二十三烷高浓度As污染处理与中浓度相比没有显著变化外，其余各处理化合物浓度均显著低于中浓度处理(P<0.05)。可见，底泥As污染促进香蒲根系正构烷烃化合物的分泌，各底泥As污染化合物浓度依次为：中浓度>高浓度>低浓度>CK。

本研究中共检测到11种正构烷烃类化合物(表3)，其中短链正构烷烃化合物有6种，长链正构烷烃化合物有5种，可以看出香蒲根系分泌的正构烷烃化合物并没有明显的长短碳链优势。香蒲根系分泌的正构烷烃化合物的碳数在C14～C26之间，其中长链正构烷烃化合物的浓度无论是在正常生长条件下还是不同底泥As浓度污染处理条件下均表现出了极大的优势。正常生境中，香蒲根系分泌的长链正构烷烃化合物占总正构烷烃化合物的63.49%，底泥低、中、高浓度As污染处理后分别占63.48%，67.81%和64.34%。

表3 As污染下香蒲根系分泌正构烷烃浓度

2.3 As污染下香蒲根系分泌正构烷烃化合物与植物生长指标相关性分析

为研究香蒲根系分泌正构烷烃化合物与植物生长和光合色素之间的相互关系，对香蒲根系分泌的各正构烷烃化合物浓度与植物生物量及植物光合色素含量进行了Pearson相关性统计。

香蒲根系分泌正构烷烃化合物浓度与植物生物量的相关性Pearson值见表4。由表4可知，除二十三烷与植物地上部分鲜重呈显著负相关关系外(P<0.05)，其余检测到的根系分泌正构烷烃化合物浓度与植物地上部分鲜重没有显著的相关关系；在检测到的11种正构烷烃化合物中，有十九烷、二十二烷、二十四烷、二十五烷和二十六烷共5种正构烷烃化合物与植物地下部分鲜重呈极显著正相关关系(P<0.01)，其中除十九烷以外，其余四种化合物均为长链烷烃；十四烷、十八烷和二十烷3种短链烷烃与植物地下部分鲜重呈显著正相关关系(P<0.05)。

香蒲根系分泌正构烷烃化合物浓度与植物光合色素的相关性Pearson值见表5。由表5可知，香蒲根系分泌的正构烷烃化合物与植物光合色素之间相互影响，在检测到的11种正构烷烃化合物中，十四烷、十九烷、二十烷、二十二烷、二十四烷、二十五烷和二十六烷7种化合物浓度与叶绿素a的含量之间存在极显著正相关关系(P<0.01)，仅有十八烷1种化合物浓度与叶绿素a的含量之间存在显著正相关关系(P<0.05)。而检测到的11种正构烷烃化合物与叶绿素b和总叶绿素的含量相关性不大。

表4 各正构烷烃化合物与植物生物量相关性分析

表5 各正构烷烃化合物与光合色素相关性分析

3 讨论

3.1 不同浓度As污染对植物生长的影响

叶绿素是植物进行光合作用的物质基础[17]，因此它对植物的生长具有极其重要的作用，而重金属对植物光合作用的影响是通过破坏叶绿体的完整性来实现[18]，叶绿体被重金属破坏之后，便使植物失绿，从而产生毒害现象。从本研究可以看出，不同浓度As处理对香蒲叶绿素的含量影响表现出“低促高抑”的现象，国内外许多学者关于As污染对植物叶绿素含量的影响都得出了相似的结论[19-21]。重金属抑制植物的光合作用己被许多研究所证实，叶片中叶绿素含量随As浓度的增加而降低，其原因是由于As进入植物体后，使叶绿素酶活性增大，导致叶绿素分解加快[22]，而在50和150 mg·kg-1As处理时，香蒲通过调整自身生理代谢过程，建立了自身防御体系，因此表现出“低促高抑”的现象。值得注意的是，高浓度As处理(600 mg·kg-1)叶绿素a/b显著高于CK(P<0.05)，从叶绿素a/b的比值可以看出，叶绿素a的降解明显低于叶绿素b，由此可知，高浓度As处理显著影响香蒲叶片内叶绿素b的含量，但对叶绿素a含量的影响相对较小，保持体内有相对较高的叶绿素a含量可以保证植物体对光能的充分利用，提高转化率。有研究认为叶绿素b含量的减少会影响到光系统的稳定性，最终导致整个光合机构的不稳定，具体表现在对逆境的耐受性降低[23-24]。综上，低、中浓度As污染，香蒲通过增加叶绿素含量和生物量，从而启动自身防御系统，增强植物耐受性；高浓度As处理严重破坏香蒲体内叶绿素b，植物对逆境耐受性降低，导致植物生长受阻(图1)。

3.2 不同浓度As污染对植物根系分泌正构烷烃的影响

植物在生长过程中，根系从环境中摄取养分的同时，也向环境中分泌质子和离子，并释放大量有机物，任何影响植物生长和生理的因素均会影响根分泌物的数量和种类[25]。本研究表明，底泥中、低浓度As污染处理植物代谢旺盛，长势良好(图1)，根系分泌的正构烷烃化合物浓度显著升高(P<0.05)(表3)。相关性分析显示，香蒲根系分泌的正构烷烃化合物浓度与植物地下部分鲜重呈显著或极显著相关关系。这与Zheng等人[26]的研究有相似的结论，植物的根系参数，如：根系体积、根密度、根重等与根系分泌物的分泌量、物质种类和数量成正相关。可见植物的生长会影响根系正构烷烃类物质的分泌，但是，底泥高浓度As污染处理，植物生长受到显著抑制，根系分泌正构烷烃化合物浓度仍然显著性高于CK，这可能是因为植物受到高浓度As污染时，植物体内的细胞膜受损的缘故。至于香蒲根系分泌的正构烷烃化合物浓度与聚光色素叶绿素a相关性显著，尤以长链正构烷烃最为显著，而与叶绿素b和总叶绿素相关性不大这个问题有待进一步研究。

高等植物的表皮覆盖着一层由长链有机化合物组成的蜡质，植物蜡质是一种复杂的混合物，其成分是长链的脂肪族和环状化合物，而正构烷烃是植物类脂的重要组成部分，最主要的功能是锁水作用，其平均碳链长度(ACL)作为植物对水分胁迫程度的生理性反映。植物在受到毒害时会增加根系分泌物的产生和积累[27-29]。本研究也得到了相同的结论，不同浓度底泥As污染处理条件下，明显改变了香蒲根系分泌的正构烷烃化合物浓度(表3)，香蒲根系正构烷烃的分泌量随As浓度的升高而表现为升高-降低的现象，且As污染处理后，根系正构烷烃的分泌量均显著高于CK(P<0.05)。这可能是香蒲植株在应对底泥As污染主动发生的防御反应，诱导根系分泌物中合成更多的正构烷烃类化合物，以抵御底泥As胁迫。目前有关植物蜡质的研究多集中在地上部分的叶表皮蜡质上，而有关植物地下部分根表皮蜡质的研究鲜有报道。本研究从香蒲的根系提取出了11种正构烷烃化合物，由此可以推测植物根系表面同样也包裹着一层蜡质，表皮蜡质是植物与外界环境接触的第一道防线，真菌与植物接触时，首先粘附于覆盖在植物最表层的蜡质层，主要靠附着胞等入侵结构粘附，而附着胞的形成较易受蜡质层的影响[30]。植物根系受到As污染污染时，植物根际可能会滋生有害细菌，根系通过增加正构烷烃化合物的分泌，增加根系表皮蜡质的含量，使有害细菌粘附于蜡质层而避免对植物根系的侵害。植物根系分泌的正构烷烃化合物是否通过一系列反应最终生成根系表面的蜡质层，根系表面的蜡质层在底泥As污染下所起的具体作用还有待进一步的研究。

4 结论

综上所述，香蒲是一种As耐受型植物，在底泥150 mg·kg-1As污染胁迫条件下不仅能完成正常的生长发育，而且长势良好；在一定浓度As污染胁迫时，香蒲通过增加其各部分生物量、叶绿素含量以及根系分泌正构烷烃化合物含量以提高植物抗胁迫能力，维持正常生长发育，当超过一定浓度As污染胁迫时，植物生长受到抑制，尤其以叶绿素b的降解最为显著；根系正构烷烃化合物的分泌与植物地下部分鲜中和叶绿素a呈显著或极显著的正相关关系。