乙烯利对干旱条件下多年生黑麦草生理指标的影响

段梦琪， 彭 春， 张 睿， 高娅楠， 李丽菁， 张智韦， 许立新*

(1.北京林业大学草坪研究所，北京100083；2.河北水利电力学院，河北 沧州061000)

干旱是影响草坪草生长和草坪质量的主要因素之一[1]。有研究表明，在干旱条件下使用植物生长调节剂可提高植物耐旱性，乙烯利是一种重要的植物生长调节剂，在作物中可用于提高植物耐旱性[2]。乙烯利可渗入植物组织，进一步分解转运为乙烯，作用于器官，从而起到调节作用[3]。乙烯介导的信号转导可改善逆境条件下的植物生长性能和发育状况[4-5]，韩露[6]、隋永超等[7]研究发现，叶片喷施乙烯利能够缓解干旱对草地早熟禾(PoapratensisL.)的胁迫程度，并且能够促进干旱胁迫后的复水恢复。尧金燕[8]、莫萍丽[9]的研究表明叶片喷施乙烯利对提高甘蔗(Saccharumofficinarum)对缺水的适应性具有积极作用，起到保护细胞膜、维持正常的渗透调节功能、降低蒸腾速率和气孔导度、提高保护酶活性的作用，并通过促进分蘖抑制增高来适应干旱缺水情况。闫秋洁等[10]的研究发现乙烯利浸种能显著缓解玉米(ZeamaysL.)的干旱胁迫程度，提高玉米种子的发芽率和幼苗高度，同时降低丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量，增强过氧化物酶(Guaiacol peroxidase，POD)和过氧化氢酶(Catalase，CAT)活性。苏黎等[11]研究发现，一定浓度的乙烯利浸种可提高不同土壤水分条件下多年生黑麦草(LoliumperenneL.)的抗旱性，但叶片喷施乙烯利是否有和浸种处理同样的作用未有进一步研究。

多年生黑麦草由于其生长分蘖快、外形美观、绿色期长和耐牧性强等优点，已成为我国乃至全世界草坪建植和饲草栽培中最受欢迎的草种之一[1]。然而与其他禾本科草相比，多年生黑麦草耐旱能力相对较弱，限制了该草进一步的广泛应用[12]。为了测试叶片喷施乙烯利对多年生黑麦草耐旱性的影响并进一步研究其可能的作用机理，本研究选取4种多年生黑麦草为植物材料，在叶片喷施乙烯利后进行干旱处理，测定耐旱性相关生理指标，分析喷施乙烯利后多年生黑麦草干旱胁迫下生理指标的变化，以期了解干旱条件下乙烯利对多年生黑麦草的影响，为后续揭示乙烯利提升草坪草耐旱性机理提供研究基础，同时也为草坪草管理实践中乙烯利的可能应用途径提供理论和数据支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料与处理

试验选用多年生黑麦草的4个品种为研究材料，分别是‘Neruda’，‘Accent’，‘MS’，‘AST’。‘Neruda’，‘Accent’种子于2017年购于北京正道生态科技有限公司，‘MS’，‘AST’种子于北京林业大学实验室保存，均存于4℃避光条件下，种子净度为98%、发芽率‘Neruda’，‘Accent’为70%，‘MS’和‘AST’为90%。于2018年6月1日进行播种，土培直播种植，植株生长于光照培养箱中，定期浇等量的水，保证水分供应，每月浇灌1次等量的霍格兰特营养液。试验于幼苗期进行，2018年8月16日喷施乙烯利，经本课题组工作人员前期试验得出喷施乙烯利方法[13]，浓度为200 mg·L-1，喷至叶片凝结水珠为止，对照组喷施纯净水，每组处理5个重复。叶片喷施处理1天后，停止浇水开始进行干旱处理，试验分别在8月17日、8月22日、8月27日进行叶片取样，取样时间对应土壤含水量分别为30.0～33.5%，8.0%～10.0%，1.0%～2.0%，8月27日取样后进行充分浇水，使土壤含水量恢复至30.0～32.5%，8月29日进行最后一次叶片取样。

1.2 测定指标及方法

土壤含水量(Soil volumetric water content，SWC)使用TDR(Time domain reflecto-metry)仪器采用时间域反射方法[14]进行测定，本研究采用10 cm波导探针探测表层土壤水分含量。叶片相对含水量(Relative water content，RWC)采用烘干法[15]进行测定。电解质渗透率(Electrolytic leakage，EL)的测定采用采用Blum和Ebercon[16]的方法。脯氨酸(Proline，Pro)采用酸性茚三酮比色法[13]进行测定。CAT活性采用紫外吸收法[17]进行测定。POD活性采用愈创木酌法[18]进行测定。抗坏血酸过氧化氢酶(Ascorbate peroxidase，APX)活性釆用Nakano和Asada[19]的方法进行测定。

1.3 数据分析

本研究中结果均采用SPSS 20.0软件对数据进行方差分析和一般线性模型单变量分析，并用平均值和标准误来表示数据结果，使用WPS办公软件中的Excel制图。

2 结果与分析

2.1 乙烯利对多年生黑麦草干旱条件下叶片相对含水量的影响

水分充足时，乙烯利处理组与对照组(干旱组)的各品种叶片相对含水量均无显著差异(图1)。干旱处理(停止浇水)10 d后，经乙烯利处理的‘Neruda’，‘MS’和‘AST’3个品种的RWC显著高于各自未经乙烯利处理的对照组(P<0.05)。干旱处理10 d时，各个品种对照组和乙烯利处理组的RWC分别是：‘Neruda’为27.64% 和38.14%，‘MS’为26.04%和36.02%，‘AST’为47.40%和59.16%。‘Accent’在干旱条件下经乙烯利处理10 d后RWC平均值高于对照组但不显著，分别为23.40%和28.68%。可以看出，在相同程度的干旱处理(10 d不浇水)下，‘AST’品种的RWC最高，‘Neruda’和‘MS’居中，而‘Accent’与这几个品种相比RWC最低。

复水恢复2 d后，各品种的RWC都得到一定程度的恢复，但不能恢复到干旱处理前水平。乙烯利处理对于‘Neruda’，‘Accent’和‘AST’3个品种的复水恢复能力没有影响，但提高了‘MS’的复水恢复能力(图1 c)，‘MS’复水恢复2天后对照组和乙烯利处理组的RWC分别为55.10 %和69.48 %。

图1 乙烯利处理对干旱条件下多年生黑麦草叶片相对含水量的影响

2.2 乙烯利对多年生黑麦草干旱条件下电解质渗透率的影响

随着干旱处理时间的延长，多年生黑麦草电解质渗透率显著上升(图2)，复水恢复处理2 d后，电解质渗透率降低。在没有水分胁迫以及轻微水分胁迫下(干旱处理5 d时)，乙烯利处理不影响多年生黑麦草的电解质渗透率(图2a，b，c)。‘Accent’未处理前电解质渗透率对照组和乙烯利处理组分别为14.17%和15.09%，绝对数值相近；由于品种差异，乙烯利处理对‘AST’的电解质渗透率抑制作用在干旱处理5 d时开始出现。当干旱处理10 d时，乙烯利处理显著降低各品种的电解质渗透率(P<0.05)，各品种的电解质渗透率分别是：‘Neruda’为47.15%和30.64%，‘Accent’为46.19% 和37.59%，‘MS’为52.62%和32.78%，‘AST’为58.68%和38.86%。复水2 d后，乙烯利处理组和对照组的电解质渗透率均明显下降，并且恢复到到处理前水平。

图2 乙烯利处理对干旱条件下多年生黑麦草电解质渗透率的影响

2.3 乙烯利处理对多年生黑麦草干旱条件下脯氨酸含量的影响

水分充足及干旱处理5 d时，各品种叶片脯氨酸含量差异不显著(图3)，对照组和乙烯利处理组差异也不显著。干旱处理10 d后，除了‘AST’品种，经乙烯利处理的其它品种相对于各自未经乙烯利处理的对照组脯氨酸含量均显著降低(P<0.05)，脯氨酸含量分别是：‘Neruda’为992.51 Ug·g-1和376.17 Ug·g-1，‘Accent’为1 188.33 Ug·g-1和851.36 Ug·g-1，‘MS’为12 697.77 Ug·g-1和6 262.81 Ug·g-1。品种‘AST’的乙烯利处理组和对照组差异不显著，为4 935.39 Ug·g-1和5 471.60 Ug·g-1。

复水恢复2 d后，脯氨酸含量均下降，但除‘MS’外其它品种都显著高于干旱处理前水平(P<0.05)(图3a，b，d)。乙烯利处理促进了‘Neruda’品种在复水恢复阶段下，脯氨酸含量的进一步下降，分别是161.96 Ug·g-1和108.36 Ug·g-1。‘Accent’，‘MS’和‘AST’3个品种的乙烯利处理组和对照组在复水恢复2 d时，脯氨酸含量差异不显著。

图3 乙烯利处理对干旱条件下多年生黑麦草脯氨酸含量的影响

综合以上结果可以看出：干旱条件下，乙烯利处理能够对本研究测试中干旱条件下的4个耐旱性不同品种的叶片相对含水量、电解质渗透率以及脯氨酸含量有不同程度的提升和缓解作用，说明本研究中浓度的乙烯利处理能够不同程度提升多年生黑麦草的耐旱性，而干旱处理5 d的结果没有干旱处理10 d结果显著。复水情况下乙烯利处理组和对照组数据差异不显著，仅有‘MS’的叶片相对含水量和‘Neruda’的脯氨酸含量因品种特异性原因差异显著。

2.4 乙烯利处理对多年生黑麦草干旱条件下抗氧化酶活性的影响

为了进一步探究乙烯利提升多年生黑麦草耐旱性的机理，本研究挑选了耐旱性有差异的2个品种‘AST’和‘MS’进行抗氧化酶活性测试，研究干旱处理10 d和未经干旱处理条件下，多年生黑麦草抗氧化酶的变化和对乙烯利处理的响应。

2.4.1乙烯利处理对多年生黑麦草干旱条件下POD活性的影响 当水分充足时，乙烯利处理组和对照组的POD活性差异不显著(图4)。干旱处理10 d后，各品种的POD活性降低，乙烯利处理组的POD活性显著高于对照组(P<0.05)，与干旱处理前保持同一水平，‘MS’对照组和乙烯利处理组的POD活性分别为1 696.67 U·g-1·min-1和4 354.58 U·g-1·min-1，‘AST’对照组和乙烯利处理组的POD活性分别为2 441.25 U·g-1·min-1和7 833.33 U·g-1·min-1。由此可知，叶片喷施乙烯利处理可以大幅提高干旱环境下多年生黑麦草POD活性。

图4 乙烯利处理对干旱条件下多年生黑麦草POD活性的影响

2.4.2乙烯利处理对多年生黑麦草干旱条件下CAT活性的影响 当水分充足时，乙烯利处理组和对照组的CAT活性差异不显著(图5)。经干旱处理10 d后，乙烯利处理组和对照组相比，品种‘MS’的CAT活性差异不显著，对照组和乙烯利处理组CAT活性分别为673.67 U·g-1·min-1和556.08 U·g-1·min-1；‘AST’的乙烯利处理组CAT活性显著提高(P<0.05)，对照组和乙烯利处理组CAT活性分别为183.00 U·g-1·min-1和595.08 U·g-1·min-1。

图5 乙烯利处理对干旱条件下多年生黑麦草CAT活性的影响

2.4.3乙烯利处理对多年生黑麦草干旱条件下APX活性的影响 没有水分胁迫时(干旱处理0 d)，乙烯利导致‘MS’品种的APX活性下降，对于‘AST’品种没有影响(图6)。干旱处理10 d，‘MS’的乙烯利处理组和对照组相比，APX活性差异不显著，‘AST’经乙烯利处理后较干旱前APX活性显著下降(P<0.05)。

图6 乙烯利处理对干旱条件下多年生黑麦草APX活性的影响

3 讨论

3.1 乙烯利对叶片相对含水量的影响

叶片相对含水量能够直接反映土壤水分对植物作用的有效性，是评估叶片内部水分变化的指标[20]。叶片相对含水量可以用作衡量植物内部水分缺失情况和持水能力的指标，是干旱条件下植物耐旱性指标之一[21-23]。卡德尔阿布都热西提的研究[24]也显示，叶片含水量随植物受干旱胁迫的增强而降低，在干旱胁迫下，抗旱性越强的植物叶片相对含水量下降越缓慢，叶片持水能力越强，细胞膜系统所受的伤害越小。

本研究表明，叶片喷施乙烯利处理可以不同程度提高干旱条件下多年生黑麦草(‘Neruda’，‘MS’，‘AST’)的叶片相对含水量(图1a，c，d)，也可以提高‘MS’品种RWC的复水恢复能力(图1c)，然而对于品种‘Accent’的RWC在干旱条件下有提升作用但不显著。干旱条件下，不同品种的RWC对于乙烯响应敏感性不同，使得乙烯利对多年生黑麦草干旱条件下RWC的提升作用存在品种差异。乙烯利处理后这4个品种耐旱性比较结果为，‘AST’的耐旱性最强，‘Neruda’和‘MS’次之，‘Accent’的耐旱性最差。从总体趋势来说，叶片喷施乙烯利可以减缓干旱胁迫下多年生黑麦草叶片相对含水量的下降，说明喷施乙烯利能够提高多年生黑麦草在干旱胁迫下的持水能力，改善植物体内的水分状况，从而增强多年生黑麦草的抗旱性。

3.2 乙烯利对电解质渗透率的影响

电解质渗透率是能够反映植物细胞膜透性的重要指标，电解质渗透率越大说明膜透性越大，植物受损伤越严重，反之同理[25]。Saneokaetal[26]指出，水分胁迫会导致细胞膜的损伤或破坏，使膜的选择透性功能减弱或丧失、透性增大、电解质外渗加剧。Paula等[27]指出维持细胞膜的完整性、稳定性以及流动性对植物应对干旱、脱水胁迫尤为重要。而尧金燕[8]的试验结果表明，干旱胁迫下乙烯利处理能降低甘蔗的电解质外渗率，提高甘蔗在水分亏缺条件下生长状况的表现。

本研究结果同样表明，干旱条件下4种多年生黑麦草的电解质渗透率上升，喷施乙烯利可以减缓在同等干旱条件下电解质渗透率的上升水平，在干旱程度加强的情况下表现尤为显著，‘Neruda’、‘Accent’、‘MS’和‘AST’4个品种反应了相同的结果(图2)。复水2 d后，4个品种对照组的电解质渗透率指标已恢复到正常水平，所以乙烯利处理组没有明显效果。由此可知，叶片喷施乙烯利处理可以降低干旱环境下多年生黑麦草的电解质渗透率，但对于电解质渗透率的复水恢复能力的提高没有明显作用。喷施乙烯利可减轻重度干旱条件下细胞膜受伤害的程度，增强膜系统的稳定性，因而提高了多年生黑麦草的耐旱性。

3.3 乙烯利对游离脯氨酸含量的影响

脯氨酸是植物在胁迫中最有效的渗透调节物质之一，它的作用主要包括渗透调节、保护生物大分子、参与氮代谢和能量代谢等[28]，在逆境胁迫下植物体内脯氨酸会大量积累。许多研究证实植物体内积累脯氨酸可以提高非生物胁迫的耐受性。朱维琴等[29]的研究表明，植物遭受水分胁迫后，脯氨酸会产生积累，这是植物响应干旱胁迫作出的重要生理反应。揭雨成等[30]的试验结果显示，苎麻在受到水分胁迫较轻的情况时，脯氨酸在抗旱性弱的品种中积累的水平反而更高，而之后随着胁迫程度的加深，游离脯氨酸在抗旱性强的品种中积累的水平更高，经过复水处理后，游离脯氨酸的含量在抗旱性强的品种中下降的速度更快。吴情[31]的试验结果也显示，多年生黑麦草受水分胁迫初期的植物应答胁迫反应使脯氨酸在植物体内积累，这种积累也可能是由于植物的细胞结构和功能在受损伤后的表现，也是种伤害反应指标。

在本研究中，干旱处理10 d时叶片喷施乙烯利处理可以抑制干旱环境下多年生黑麦草‘Neruda’，‘Accent’和‘MS’3个品种的脯氨酸合成；对于‘AST’品种的脯氨酸含量抑制作用不显著，可能由于‘AST’耐旱性较强，干旱处理10 d没有全面触发‘AST’品种的脯氨酸代谢和乙烯交叉响应机制。复水2 d后，只有‘MS’品种的脯氨酸含量降低到处理前水平，其他品种脯氨酸含量未降低到处理前水平，说明‘MS’的复水恢复能力较强。‘Neruda’品种经乙烯利处理后脯氨酸含量显著低于对照组(P<0.05)，可能是因为该品种抗旱能力较弱，对乙烯利响应敏感所至。未来有待进一步研究更长时间干旱处理下，乙烯利对此品种脯氨酸含量的影响。喷施乙烯利改善了多年生黑麦草体内含水量(RWC)，减轻了干旱对细胞膜的伤害，调节了植物细胞内环境，缓解了植物受干旱胁迫的程度，脯氨酸作为伤害指示指标，在干旱条件下，喷施乙烯利后含量较对照组显著下降，说明乙烯利缓解了干旱条件下多年生黑麦草的细胞损伤。

3.4 乙烯利对抗氧化酶活性的影响

干旱等环境胁迫诱导植物产生大量的活性氧基团或分子(ROS)破坏植物细胞，这些活性氧基团或分子包括单线态氧(1O2)，超氧化物(O2-)，过氧化氢(H2O2)，和羟基自由基(-OH)[32-34]。这些ROS能够与脂质、核酸和蛋白质相互作用，引起细胞损伤[35]。许多植物物种已具备完善的抗氧化防御系统，以保护细胞免受由逆境诱导产生的活性氧基团或分子的伤害，提高抗氧化相关的酶的活性就是其中的一项防御机制，这些酶包括超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化氢酶(CAT)，过氧化物酶(POD)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)[36-37]等。许立新等[23]指出，在抗氧化酶系统中SOD与CAT共同作用可以将有害的H2O2和O2-转化成无害的H2O和O2；CAT和APX对于清除H2O2也起到了重要的作用；POD则能催化依靠H2O2参与的底物氧化反应。本研究中，在土壤重度干旱时，品种‘MS’和‘AST’的乙烯利处理组POD活性显著高于对照组，这说明乙烯利处理能够增加干旱条件下POD活性，从而有效清除过多的过氧化氢，阻止过氧化物对细胞膜的伤害，保护膜结构的稳定。干旱条件下，乙烯利处理对多年生黑麦草APX和CAT的活性变化影响不明显。因此，干旱胁迫下，POD可能是多年生黑麦草响应乙烯利处理的抗氧化酶系统的主效因子，清除大量活性氧基团或分子,从而提升多年生黑麦草的耐旱性。

4 结论

叶片喷施乙烯利可以提升多年生黑麦草的耐旱性，但对不同品种、不同材料的作用幅度和方式不同，表现为生理指标的响应和变化规律不同。例如在干旱处理10 d时，乙烯利处理显著提高了‘Neruda’、‘MS’和‘AST’3个品种的叶片相对含水量，而‘Accent’的叶片相对含水量平均提高了22.56%，但差异不显著。此外，乙烯利促进‘MS’和‘AST’干旱胁迫下的POD酶活性的提升，但仅有‘AST’的CAT酶活性大幅提升(225.18%)。不同材料对乙烯利处理响应的差异性解释机理还有待于进一步研究。总体来看，乙烯利提高了干旱胁迫下多年生黑麦草的叶片持水能力，缓解了干旱胁迫诱导的膜受损程度，提升了抗氧化能力，但在实践应用中需注意用量方法并考虑品种差异性。