4种豆科栽培牧草根际土壤细菌群落分布特征研究

苏贝贝， 张 英， 道日娜

(青海大学农牧学院， 三江源区高寒草地生态省部共建重点实验室， 青海 西宁 810016)

在草地生态系统中，豆科牧草作为特殊的功能组，对整个机制的运转起着重要的作用[1]，并且其在营养价值方面也比禾本科牧草更为优秀[2]，是牲畜的优良饲料。近年来，社会经济的迅速发展和人为活动的影响，以及自然环境等因素的干扰，共同导致了高寒地区土壤质量下降、退化速度加快、生产力低下，从而严重制约了畜牧业生产和地区经济的可持续发展[3-5]。目前国内对于豆科牧草的研究较多，诸多学者从生态系统角度、物质能量循环角度及土壤理化特性角度进行了分析[6]，对于豆科牧草根际微生物的研究也较多，主要集中在微生物的分离鉴定及资源库的建立等方面[7]，而从土壤微生物群落结构和多样性的角度对豆科牧草的研究鲜有报道。

土壤生态系统中最具有生命活力的重要组成是土壤微生物[8-9]。土壤生态系统的结构以及功能不断影响着微生物群落多样性的变化[10]，进而成为土壤肥力和生态保持方面不可或缺的重要因素[11-12]。由于土壤微生物对周边环境具有敏锐的反应能力，可以对外界的变化快速地做出响应，从而对植物群落的物种多样性和土壤结构的形成产生一定的影响[13-14]。因此，土壤微生物群落结构和多样性的变化不仅是衡量草地生态系统健康的条件之一，还是反映草地退化或恢复程度的指标之一[15-17]。在对于可培养微生物研究方面，之前研究所采用的传统DNA测序方法通常所取得的信息量少且耗时较长，很难使人们对土壤微生物群落进行深入的研究。通过利用Illumina HiSeq PE250高通量测序技术可以较为全面地反映土壤微生物群落结构，并且相较于传统DNA测序方法具有更高的准确性和灵敏度等优势[18-19]。本研究采集同一地区4种豆科栽培牧草的根际土壤，通过研究土壤的理化性质和微生物多样性，以期揭示同一地区栽培豆科牧草根际土壤微生物多样性的差异及变化规律，为高寒地区豆科牧草的可持续开发与利用以及植物根际土壤微生物的后续研究提供基础理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

研究样地位于青海省牧草良种繁育场(35°15′28″ N，100°39′16″ E)，年平均气温为0.2℃，全年≥0℃的活动积温为1 503.0℃，全年无绝对无霜期，年平均降水量为430.0 mm，年平均蒸发量为1 352.5 mm，平均海拔高程3 220 m。该地区海拔高，多风而寒冷、夏季凉爽，适合牧草生长。

1.2 试验设计和样品采集

选择4种豆科栽培牧草为研究对象，2019年4月20日进行播种，种植面积为5 m×8 m，3次重复，条播，行距为40 cm，播种量分别为扁蓿豆(Melissilusruthenicus(L.)Peschkova(TrigonellaruthenicaL.))(样品编号TDB)24 Kg·hm-2、紫花苜蓿(MedicagosativaL.)(样品编号TDZ)22.5 Kg·hm-2、红豆草(Onobrychisviciifolia)(样品编号TDH)30 Kg·hm-2、蚕豆(ViciafabaL.)(样品编号TDC)220 Kg·hm-2，随机区组试验设计如图1所示。2019年8月20日采样，各处理田采用5点取样法取样，采集0～20 cm植物根系及土壤样品，抖落根系大块土壤，收集根上0～5 mm的土壤作为根际土[20]，立即装入无菌密封袋，并低温带回实验室，样品分为两份，一份于—80℃冰箱保存，用于DNA提取，另外一份风干过筛用于土壤理化性质的测定。

图1 随机区组试验设计图

1.3 测定指标与方法

1.3.1土壤理化指标 测定4种豆科栽培牧草根际土壤的理化性质采用常规方法[21]：pH值的测定采用酸度计电位法；速效氮含量的测定采用氯化钾浸提-分光光度计法；速效磷含量的测定采用NaHCO3浸提-钼锑抗比色法；速效钾含量的测定采用醋酸铵浸提-火焰光度计法；全氮含量的测定采用纳氏比色法；全磷含量的测定采用钼锑抗比色法；全钾含量的测定采用火焰光度计法；有机质含量的测定采用高温外热重铬酸钾氧化—容量法。

1.3.2土壤总DNA提取及基因扩增 采用OMEGA试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]提取豆科栽培牧草根际土壤样品中的微生物DNA基因组，每个样品进行3次重复，以降低DNA提取过程中的操作误差，采用Illumina HiSeq PE250测序平台的通用引物(341F和805R)对细菌16S rRNA基因V3～V4区域进行PCR扩增，扩增体系参照赵帆等[22]的方法，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测合适后，送至生工生物工程股份有限公司(上海)，在Illumina HiSeq PE250测序平台，利用双末端测序的方法对PCR扩增产物进行测序分析[23]。

1.4 生物信息学分析

根据Barcode序列和PCR扩增引物序列从下机数据中拆分出各样品数据，截去Barcode和引物序列后对Reads进行拼接[24]得到原始Tags数据(Raw Tags)；对原始测序数据进行过滤和去除嵌合体序列，最终得到有效数据(Effective Tags)；使用Qiime软件对Tags在97%的相似度水平下进行OTUs聚类，用Mothur[25]方法与SILVA软件的SSUrRNA数据库进行物种注释(阈值0.8～1.0)；采用PyNAST软件[26]与GreenGene数据库中数据信息进行多序列比对，最后对测序数据进行标准化处理，采用Qiime1.7.0软件进一步进行α多样性分析、β多样性分析和显著物种差异分析等，采用使R软件(2.15.3)绘制稀释曲线。通过R语言工具绘制热图，采用非加权配对平均法进行层次聚类绘制系统发育树。

1.5 数据分析

所有数据经过Excel 2013处理，采用SPSS 21.0软件对数据进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，Duncan新复极差法进行差异显著性检验(P<0.05)。土壤因子与细菌种群分布特征之间的关系，采用Pearson相关系数法进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 土壤理化性质

4种不同豆科栽培牧草根际土壤理化性特征测定结果如表1所示，结果表明4种豆科栽培牧草根际土壤的pH值在8.02～8.25之间，样品TDB和TDH间pH值差异显著(P<0.05)，全氮含量变化范围为1.10～2.79 g·kg-1，全磷含量范围在1.96～3.44 g·kg-1之间，全钾含量范围为23.85～24.81 g·kg-1，样品TDC与其他样品的土壤全钾含量差异显著(P<0.05)，速效氮含量范围为78.00～187.00 mg·kg-1，速效磷含量范围为19.30～75.20 mg·kg-1，速效钾含量范围为78.00～168.00 mg·kg-1，有机质含量范围为16.39～41.73 g·kg-1。TDB样地的全氮、全磷、速效氮、速效磷、速效钾及有机质含量显著低于其他样地(P<0.05)，TDC样地的全磷、全钾含量显著高于其他样地(P<0.05)。

表1 土壤理化性质特征

2.2 土壤细菌群落丰度与Alpha多样性分析

通过Illumina HiSeq PE250高通量测序技术，共得到有效序列234 099条，序列长度相对集中，平均长度分别为413 bp，418 bp，418 bp，417 bp，聚类共得到5 707个OTUs。样本文库的覆盖度均在99.5%以上，结合图2平缓的样品稀释曲线，可知该测序数据合理，能够充分反映出土壤细菌群落的真实信息。4种豆科栽培牧草根际土壤细菌群落丰富度指数(Chao1和ACE指数)依次为TDC>TDH>TDZ>TDB(表2)；细菌群落多样性指数中Simpson指数依次为TDB>TDH=TDC>TDZ；Shannon指数依次为TDZ>TDC>TDH>TDB。在97%的相似度水平下，得到了每个样品的OTU个数，如Venn图(图3)所示，所有样品中共有OTUs数目为696个，其中TDB，TDC，TDH，TDZ所特有的OTUs数目分别为26，62，16和16个。

图2 样品稀释曲线

图3 样品韦恩图

表2 样品序列数统计、丰富度与多样性指数

2.3 土壤细菌群落分布特征

2.3.1门水平上的组成 通过测序发现，4种豆科栽培牧草根际土壤细菌群落结构在门水平上具有较高的多样性(图4)，各样品土壤细菌分属于25个门，相对丰度>1%的菌门为：变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、Saccharibacteria、浮霉菌门(Planctomycetes)。通过对4种栽培牧草根际土壤细菌各门所占比例分析发现，各样品在门分类水平上的菌群落丰度存在一定的差异。其中变形菌门最为丰富，在TDB，TDC，TDH，TDZ样品中的相对丰度分别为58.14%，35.83%，45.40%，38.15%。拟杆菌门在TDH样品中相对丰度较高，为22.49%，显著高于其他3个样品(P<0.05)。放线菌门在TDC样地中的相对丰度(为19.56%)显著优于其他3个样品(P<0.05)。

2.3.2属水平上的组成 在属分类水平上，4种豆科栽培牧草根际土壤细菌分属于291个属，相对丰度>1%的细菌类群如图5所示，分别为鞘氨醇单包菌属(Sphingomonas)，新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium)，不可培养芽单孢菌属(uncultured_bacterium_f_Gemmatimonadaceae)，土地杆菌属(Pedobacter)，Pseudarthrobacter，黄杆菌属(Flavobacterium)，不可培养亚硝化单胞菌属(uncultured_bacterium_f_Nitrosomonadaceae)，不可培养酸微菌属(uncultured_bacterium_o_Acidimicrobiales)，不可培养Subgroup(uncultured_bacterium_f_Blastocatellaceae_[Subgroup_4])，根瘤菌属(Rhizobium)。其中新鞘氨醇杆菌属在TDB样地土壤细菌中为优势类群，相对丰度为31.01%，鞘氨醇单包菌属在TDC，TDH，TDZ样品中相对丰度较高，显著高于其他细菌类群，相对丰度分别为14.96%，9.25%，11.53%，4种豆科栽培牧草根际土壤细菌土壤在属分类水平上，相对丰度存在显著差异(P<0.05)。

图4 门分类水平下的细菌群落相对丰度

图5 属分类水平下的细菌群落相对丰度

2.4 Beta多样性分析

选用非度量多维标定NMDS分析法来衡量4个样品间的相异系数。图6中点分别表示各样品，不同颜色代表不同分组，各点之间的距离表示差异程度，当Stress小于0.2时，表明NMDS分析具有一定的可靠性，在坐标图上距离越近的样品，相似性越高。由图6可知，4种不同豆科栽培牧草根际土壤样品，TDH和TDZ之间点距离较近，说明红豆草和紫花苜蓿根际土壤的细菌群落构成相似，而样品TDB和TDH，TDZ，TDC 3个样品之间点距离较远，说明扁蓿豆牧草根际土壤和另外3种豆科牧草根际土壤的细菌群落结构差异较大。通过对各样品在属分类水上进行加权Unifrac距离的UPGMA(Unweighted pair-group method with arithmetic mean)聚类分析(图7)，TDH与TDZ样地间细菌群落组成及丰度相似性较高，与TDB样地间细菌群落组成差异性较大。

图6 NMDS分析图

2.5 土壤理化性质与细菌优势类群的相关性

对门水平丰度较高物种与土壤理化性质的相关性分析(表3)表明：土壤pH与变形菌门、放线菌门、Saccharibacteria丰度呈正相关关系，与其他细菌类群丰度呈负相关关系。土壤全氮、全磷、速效磷、有机质含量与酸杆菌门、芽单胞菌门、绿弯菌门、疣微菌门、硝化螺旋菌门、浮霉菌门丰度呈正相关关系，与Saccharibacteria丰度呈显著负相关关系(P<0.05)，与变形菌门、拟杆菌门、放线菌门呈负相关关系。土壤全钾含量与酸杆菌门、放线菌门、芽单胞菌门、绿弯菌门、硝化螺旋菌门、浮霉菌门丰度呈正相关关系，与变形菌门、拟杆菌门、疣微菌门、Saccharibacteria丰度呈负相关关系。土壤速效氮、速效钾含量与拟杆菌门、酸杆菌门、芽单胞菌门、绿弯菌门、疣微菌门、硝化螺旋菌门、浮霉菌门丰度呈正相关关系，与变形菌门、放线菌门、Saccharibacteria丰度呈负相关关系。

图7 属水平上物种组成的UPGMA聚类树图

2.6 土壤理化性质与细菌多样性的相关性

对4种豆科栽培牧草根际土壤细菌群落多样性与土壤理化性质进行相关性分析，结果表明(表4)，土壤细菌群落丰富度Chao1指数与土壤全磷含量呈极显著正相关关系(P<0.01)，与土壤全氮、速效磷、有机质含量呈显著正相关关系(P<0.05)；土壤细菌群落多样性指数Shannon与土壤速效磷含量呈显著正相关关系(P<0.05)，与全氮、全磷、全钾、速效氮、速效钾、有机质含量呈正相关关系。

表3 门水平物种与土壤理化性质的相关性

表4 不同豆科栽培牧草根际土壤细菌群落多样性与土壤理化性质的相关性

3 讨论

草地土壤生物在草地生态系统中占据着重要的部分，土壤微生物在土壤生化过程中几乎推动着所有的反应，对生态系统的功能有着重要意义[27-29]。本研究发现，同一地区的不同豆科牧草根际土壤微生物生态结构及其变化规律存在显著性差异。本研究Alpha多样性分析结果表明，细菌群落Chao1指数依次为TDC>TDH>TDZ>TDB；细菌群落Shannon指数依次为TDZ>TDC>TDH>TDB。β多样性分析结果表明，TDH与TDZ间的细菌多样性相似度较高，与TDB样地差异性较大。形成此差异的主要因素可能与牧草品种、根系分泌物和土壤理化性质等因子有关[30]。有研究表明蚕豆根系发达，丰富的地上生物量所需的养分比其他3种较多，足够的分泌物能够促进微生物群落的生长[31]。有学者研究证实，不同植物根际微生物多样性指数和均匀度指数存在明显差异[21-34]，这与本研究结果一致。

陈孟立等[35]对黄土丘陵区退耕还林还草对土壤细菌群落结构的影响进行了研究，结果发现细菌主要有变形菌门、放线菌门、酸杆菌门、绿弯菌门、芽单胞菌门、厚壁菌门，这与本研究在门水平上的细菌群落组成所得的结果相似，但细菌群落组成丰度存在差异，在本研究中，相对丰度较高的细菌菌门为变形菌门、拟杆菌门、酸杆菌门、放线菌门、芽单胞菌门和绿弯菌门。刘洋等[36]通过对黄土高原不同植被类型下土壤细菌群落特征研究发现，该研究区土壤中的优势菌门为变形菌门、放线菌门、酸杆菌门、绿弯菌、浮霉菌门，并且验证了变形菌门为碱性土壤中的主要优势菌群，这与本研究结果一致。酸杆菌门一般存在于营养比较匮乏的环境，放线菌门能够降解纤维素和几丁质，是土壤养分供给的主要来源，并且产生的孢子能够抵抗外界不利的环境条件，使得它成为高寒草地土壤的优势菌群[37]。绿弯菌门是一类通过光合作用产生能量的细菌，高寒地区常年光照时间长，特殊的地理位置为绿弯菌等微生物的繁殖和生长创造了有利的条件[38]。许多学者研究证实[39-41]，土壤微生物与土壤环境因子进行复杂的相互作用，并且存在密切的联系，本研究采用不同种豆科栽培牧草在同一地区且相同栽培管理条件下，细菌群落组成及相对丰度差异显著，根际土壤理化性质间也存在显著性差异。通过土壤理化性质与细菌优势类群、细菌多样性的相关性分析表明，4种豆科栽培牧草根际土壤细菌群落多样性与土壤全磷、速效磷、全氮、全钾、速效氮、速效钾、有机质的含量及土壤pH间存在一定的相关性，其中土壤全氮、全磷、速效磷和有机质可能是主要驱动因素。李海云等[42]发现东祁连山退化高寒草地土壤细菌种群数量的变化主要受土壤环境因子的影响，如pH、电导率、速效氮、速效钾等。汪焱等[43]的研究结果表示，燕麦根际土壤微生物群落多样性与土壤的理化性质间存在显著相关关系，其中主要的驱动因素是土壤pH、全磷、速效磷含量。朱瑞芬等[44]研究表明，土壤pH、土壤有机质与羊草根际土壤细菌多样性呈显著正相关。Peng等[45]在次生演替林经历土壤微生物群落结构和土壤有机质的紧密耦合变化研究中揭示了土壤有机质数量以及质量是驱动土壤微生物群落结构构建的主要因素，这与本次研究结果一致。土壤pH被广泛认为是全球微生物多样性和丰富度的最佳预测因子[46-47]，然而，在本次研究中，细菌物种的丰富度和多样性并没有与土壤pH呈显著的相关性，这可能是由于本研究观察到的pH范围较窄(8.02～8.25)。草地土壤微生物群落分布直接影响了植物的健康情况，因此，探究植物根际土壤微生物和土壤理化性质之间的关系为今后维持高寒草地生态系统和发展畜牧业奠定了理论基础。

4 结论

本研究结果表明同一地区种植的4种豆科栽培牧草根际土壤理化性质存在显著差异，根际土壤的细菌群落组成丰度较高，但同一地区种植的4种豆科栽培牧草根际土壤微生物种群结构具有一定的差异性。通过高通量测序技术，共得到有效序列234 099条，聚类共得到5 707个OTUs；土壤细菌群落丰富度指数表现为蚕豆>红豆草>紫花苜蓿>扁蓿豆；多样性指数表现为紫花苜蓿>蚕豆>红豆草>扁蓿豆；在门分类水平上，细菌群落中变形菌门是最优势菌群；Beta多样性分析表明，红豆草样地与紫花苜蓿样地间的细菌多样性相似度较高，与扁蓿豆样地差异性较大；通过相关性分析，高寒地区不同豆科牧草根际土壤细菌群落多样性与土壤理化性质存在显著相关关系，其中土壤全氮、全磷、速效磷和有机质可能是主要的驱动因子。