柳枝稷PvJAZ1基因的克隆、表达特性与亚细胞定位

王 燕， 赵晓晓， 王伟伟

(1. 杨凌职业技术学院， 陕西 杨凌 712100； 2. 高邑县第一中学， 河北 石家庄 051330；3. 西北农林科技大学农学院,陕西 杨凌 712100)

茉莉酸是一种脂蛋白类植物激素，它可以作为信号分子参与调节植物生长发育和胁迫信号应激反应的多个生物学进程[1]。JAZ蛋白(JAZs)属于TIFY基因家族的JAZ亚家族成员，主要包含ZIM和Jas两个保守的功能结构域，ZIM结构域包含一个保守的TIF [F/Y] XG(TIFY)基序[2-3]；此外，C末端的Jas结构域中还存在着核定位信号，这使得JAZ蛋白具有核定位的特性[4-5]。JAZ蛋白是JA信号转导中的关键调控因子，当植物细胞含有较低浓度的JA时，JAZ蛋白与转录激活因子MYC2使得JA早期应答基因受到抑制，植物受到上游信号刺激后，JA在植物细胞中合成并积累，高浓度的JA可以解除JAZ蛋白对转录激活因子MYC2转录活性的抑制，从而激活JA早期应答基因的表达[6-8]。

柳枝稷(PanicumvirgatumL.)是多年生禾本科黍属C4草本植物，它植株高大、根系发达，生物质产量可达20 t·hm-2以上，可用于火力发电、以木质纤维素生产乙醇和生态环境保护等[17-18]。因具有生物质产量大、纤维素含量高、抗逆性强、可在边际土地生长、水肥需求少、对环境友好等优点，柳枝稷被认为是一种具有较大发展潜力的能源作物[17,19]。由于植物的固着特性，柳枝稷经常会受到干旱、洪涝和盐碱等非生物胁迫，对其生物质产量造成较大影响[20-21]。JAZ基因的功能研究多集中在拟南芥和水稻中，在柳枝稷中还未见报道，本研究从柳枝稷中克隆获得PvJAZ1基因，并对其分子特征、表达特性和亚细胞定位等进行了分析，以期为探讨柳枝稷生长发育和抗逆性分子调控机制解析提供基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验中PvJAZ1基因的克隆和定量分析使用的是柳枝稷‘Alamo’群体品种，亚细胞定位使用的是本氏烟草(Nicotianabenthamiana)，均由西北农林科技大学小麦柳枝稷遗传改良研究团队提供。

1.2 试验材料的种植和处理

挑选籽粒饱满、大小均匀的‘Alamo’种子，先后使用70%无水乙醇表面消毒1 min、10%次氯酸钠溶液灭菌5 min，然后使用无菌水冲洗3～4次，置于4℃条件下过夜，次日将处理过的种子置于带有滤纸的培养皿上，于27℃(光照16 h/黑暗8 h)光照培养箱中生长。待幼苗根长2 cm左右时，转移至水培容器内继续在光照培养箱内培养，每隔两天换一次培养液，水培3周后用于激素与胁迫处理。激素处理是在叶片上喷洒0.01 mM JA(茉莉酸)，0.01 mM IAA(生长素)，0.01 mM SA(水杨酸)，0.03 mM Eth(乙烯)，0.01 mM GA(赤霉素)和0.01 mM ABA(脱落酸)，在处理0，2，6和12 h后取样[22]；冷处理是将幼苗转移到4℃的培养箱中，干旱处理是将完整的植株暴露在空气中，不进行水分补给，盐处理是将幼苗转移到200 mM的NaCl盐胁迫溶液中，在处理0，4，12和24 h后取样[23]。取材部位均为叶片，每个处理进行3个生物学重复，经液氮迅速冷冻处理后于-80℃超低温冰箱中保存。

取大田正常生长柳枝稷的幼穗用于基因克隆的模板，取大田正常生长柳枝稷E4期生长的根、茎、叶、节、鞘、R3期的小穗和S5期的种子进行组织特异性表达分析[24-25]，每个处理进行3个生物学重复，液氮迅速冷冻后置于-80℃超低温冰箱中保存。试验地位于西北农林科技大学北校区(108°04′26″ E，34°17′49″ N)，取材日期为2018年5-10月。

采用土培法种植本氏烟草于光照培养箱内，培养条件为：25℃，14 h光照/10 h黑暗，光照强度为150 μmol·m-2·s-1，相对湿度为70%。

1.3 基因克隆

通过JGI数据库(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#)进行blastn比对，获取OsJAZ1(LOC_Os04g55920.1)在柳枝稷中的同源基因为Pavir.7KG425400.1。利用TRIZOL法提取柳枝稷幼穗的总RNA，以RNA反转录的cDNA为模板(PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit,TaKaRa,Dalian,China)进行PCR扩增，扩增体系为：2 × Phanta Max Buffer 25 μL，灭菌ddH2O 18 μL，稀释5倍后的cDNA 3 μL，10 mM的dNTP Mix 1 μL，10 μM的上下游引物各1 μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL；PvJAZ1基因的上下游引物序列分别为PvJAZ1-F和PvJAZ1-R(表1)。扩增程序为：95℃预变性3 min，95℃变性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸30 s，共进行34个循环，最后72℃彻底延伸7 min，4℃保存。利用琼脂糖凝胶电泳分离目的条带(1%琼脂)，经回收纯化后连接到克隆载体pClone007(TsingKe Biotech,Beijing,China)，菌液PCR检测后进行测序。

1.4 基因的分子特征

利用ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)分析基因的开放阅读框，ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)分析基因编码蛋白的理化性质，SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)预测基因编码蛋白的二级结构，ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)对基因编码蛋白进行疏水性分析，SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测基因编码蛋白的信号肽位点，TMHMM Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)预测基因编码蛋白的跨膜结构域，利用NCBI-CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析基因编码蛋白的保守结构域，利用NCBI-blastp(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)搜索PvJAZ1蛋白的同源序列，在DNAMAN进行多序列比对，分析PvJAZ1蛋白的保守结构域，利用MEGA5.05软件构建系统进化树(邻接法，1 000次自举值)，通过MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)在线软件对PvJAZ1蛋白进行保守基序的分析(查找数量为10个，其它参数默认)。利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在PvJAZ1基因编码区上游2 000 bp序列中检测顺式作用元件。

1.5 基因的表达特性

利用TRIZOL试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)分别提取激素处理、胁迫处理和组织特异性表达材料的总RNA，参照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa,Dalian,China)说明书进行反转录，使用Primer Premier 6.0(PRIMER-e,Auckland,NZ)设计基因上下游特异引物qPCR-F和qPCR-R(表1)，内参基因为EF-1-alpha[26](表1)，按照TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa,Dalian,China)说明书配置荧光定量PCR体系；使用QuantStudioTM3 Flex Real-Time PCR System(Thermo Fisher，MA，USA)进行PCR反应，反应步骤为两步法：95℃下10 min；95℃下5 s，60℃下30 s，共进行40个循环。利Microsoft Excel 2016(Microsoft Corporation,Redmond,WA,USA)和SigmaPlot 12.5 (Systat Software Inc,Washington,USA)软件处理数据和制作图表，以2-△△CT法计算PvJAZ1基因的相对表达量[27]，通过IBM SPSS Statistics 23.0(IBM Corporation,Armonk,NY,USA)对数据进行显著性分析。

表1 引物序列

1.6 基因的亚细胞定位

以载有目的基因的克隆载体pClone007质粒为模板，按照ClonExpress®Ⅱ One Step Cloning Kit说明书设计引物进行一步克隆(Vazyme Biotech Co.,Ltd,Nanjing,China)，上下游引物分别为GFP-F和GFP-R(表1)，利用高保真酶进行PCR扩增，同时使用BglⅡ与SpelⅠ酶切瞬时表达载体pCEGFP-sGFP65T，将PCR扩增产物与双酶切产物回收纯化后重组并转化大肠杆菌以进行PCR检测，重组步骤和体系按照ClonExpress®Ⅱ One Step Cloning Kit说明书进行操作，选取阳性菌液送测序。以构建成功的瞬时表达载体质粒转化农杆菌GV3101，选取阳性菌液送测序，测序无误后将对应菌液扩繁以备侵染。参照Sparkes等人[28]的方法将农杆菌重悬液注射于生长状态较好的烟草叶片，2天后取注射部位叶片于激光共聚焦显微镜FV1000(OLYMPUS,Tokyo,Japan)下观察GFP融合蛋白绿色荧光。

2 结果与分析

2.1 柳枝稷PvJAZ1基因的克隆和氨基酸序列分析

通过JGI基因组数据库获取柳枝稷Pavir.7KG425400.1基因的mRNA序列，PCR扩增产物经凝胶电泳检测，在750 bp处发现符合预期大小的特异条带如图1，经产物回收、连接克隆载体、转化大肠杆菌和菌液PCR检测后进行测序，结果如图2所示，Pavir.7KG425400.1克隆全长为690 bp，包含的ORF序列长630 bp，通过DNAMAN序列比对发现其与Pavir.7KG425400.1的CDS序列完全匹配；柳枝稷Pavir.7KG425400.1基因是通过对水稻OsJAZ1基因进行同源比对获取的，因而命名为PvJAZ1。

图1 柳枝稷PvJAZ1基因PCR扩增产物

图2 PvJAZ1的CDS全长及对应的蛋白序列

2.2 柳枝稷PvJAZ1基因编码蛋白的理化性质和二级结构分析

通过ExPASy ProtParam tool分析PvJAZ1理化性质，结果如下：该蛋白的分子式为C951H575N273O313S11，相对分子量为22.19 kDa，理论等电点是6.64，含量较高的氨基酸包括Ala(13.4%)、Ser(11.5%)、Glu(9.6%)和Pro(8.6%)。正负电荷残基数均为25，消光系数为0.207(假定半胱氨酸都是胱氨酸)或0.201(假定半胱氨酸都被还原)，半衰期为30 h，脂肪系数为72.01；不稳定系数为80.89，属于不稳定蛋白；总平均亲水性为—0.429，属于亲水性蛋白。

利用SOPMA软件预测PvJAZ1的二级结构有4种类型，包括α螺旋(27.75%)、延伸链(11.48%)、β转角(6.70%)和无规则卷曲(54.07%)，具体分布如图3所示。

2.3 柳枝稷PvJAZ1的序列保守性分析

将PvJAZ1的氨基酸序列提交到NCBI进行保守结构域分析，如图4所示，PvJAZ1含有TIFY基因家族JAZ亚家族保守的TIFY与CCT-2/Jas结构域，表明PvJAZ1属于JAZ转录因子家族成员。

图3 PvJAZ1二级结构

图4 PvJAZ1的保守结构域

将PvJAZ1蛋白序列提交到NCBI-blastp进行同源比较，结果表明PvJAZ1与哈氏黍Panicumhallii(XP_025824963.1)同源性最高，为93.20%；其次是糜子Panicummiliaceum(RLM65417.1)、谷子Setariaitalica(XP_004960252.1)、玉米Zeamays(PWZ38779.1)，同源性分别为87.08%，81.25%，79.82%；与高粱Sorghumbicolor(XP_002447236.1)、二穗短柄草Brachypodiumdistachyon(XP_003580712.1)、弯叶画眉草Eragrostiscurvula(TVU16401.1)、水稻Oryzasativa(XP_015635689.1)和小麦Triticumaestivum(SPT20417.1)的同源性分别为76.82%，76.33%，72.99%，69.27%和68.25%。对以上同源蛋白进行多序列比对分析(图5)，结果显示这些蛋白都具有高度保守的TIFY结构域和CCT-2/Jas结构域。

图5 柳枝稷PvJAZ1蛋白与其它物种的同源序列比对

2.4 柳枝稷PvJAZ1基因的系统进化分析

将各物种的同源序列提交至MEGA 5.05，经多重序列比对后采用邻接法构建系统发育树(图6)，发现柳枝稷PvJAZ1与糜子亲缘关系最近，其次是哈氏黍、玉米和高粱。模体分析显示这些物种具有相似的保守结构域，并且它们都包含有保守的TIFY(Motif2)结构域和CCT-2/Jas(Motif1)结构域。

图6 PvJAZ1蛋白及其同源基因的系统进化和模体分析

2.5 柳枝稷PvJAZ1基因的启动子分析

通过PlantCARE对PvJAZ1的启动子进行顺式作用元件分析(表2)，发现PvJAZ1基因启动子主要包含有光响应元件、非生物胁迫响应元件、激素响应元件和生长发育响应元件等。参与光响应的元件主要包含有G-box，GT1-motif，AE-box，GATA-motif，TCT-motif和Box 4；参与干旱、低温和伤害等非生物胁迫相关元件主要包含有DRE core，MBS，LTR，ARE，W box和WUN-motif；与MeJA，ABA和IAA等激素相关的顺式作用元件主要包含有TGACG-motif，ABRE，CGTCA-motif和TGA-element；参与分生组织特异性激活和种子特异性调控的顺式作用元件包含有CCGTCC-box和RY-element。

2.6 柳枝稷PvJAZ1基因的表达特性分析

柳枝稷PvJAZ1在不同激素与胁迫处理下的表达特性如图7所示(P<0.05)：PvJAZ1在JA处理下的2 h表达量下降为对照的0.7倍；在IAA处理下表达量迅速升高，在12 h处上调达到了对照的3.4倍；SA处理下在12 h达到最大，为对照的1.9倍；Eth和GA处理下的表达量在6 h的表达量最大，分别为对照的2和2.2倍；ABA处理下在2 h的表达量为对照组的1.4倍，之后下降后升高。PvJAZ1在盐胁迫下表达量迅速升高后逐渐降低，在2 h处理下上调达到了对照的31倍；在干旱胁迫下表达量则先降低后逐渐升高，在24 h处理下的表达量达到了对照的2.8倍；在冷胁迫下表达量有降低的趋势，在24 h下下降为对照组的0.6倍。总的来说，PvJAZ1受IAA的诱导而被JA抑制，对Eth和ABA的响应强度相对较弱；PvJAZ1对盐胁迫的诱导响应最为迅速且强烈，同时受到干旱胁迫的诱导，在冷胁迫下则呈现较低的敏感性。

基因在不同的组织、器官和生长发育时期具有不同的表达模式。本研究选取柳枝稷的根、茎、叶、节、叶鞘、种子和小穗用于组织特异性表达分析(P<0.01)，结果表明PvJAZ1基因在小穗中的相对表达量极显著高于根、茎、叶、节、鞘和种子，是根含量的739倍；PvJAZ1在根、茎、叶、节、鞘和种子之间的相对表达量不具有显著差异。

表2 PvJAZ1启动子区域包含的顺式作用元件

图7 PvJAZ1在多种激素与胁迫处理下的表达模式

图8 PvJAZ1的组织特异性表达模式

2.7 柳枝稷PvJAZ1的亚细胞定位分析

为了确定柳枝稷PvJAZ1在本氏烟草中的的亚细胞定位，本研究构建了pCEGFP-sGFP65T-PvJAZ1融合表达载体，转化农杆菌GV3101后侵染烟草植株。如图8所示，pCEGFP-sGFP65T(空载)在烟草表皮细胞和细胞核中能检测到荧光信号；pCEGFP-sGFP65T-PvJAZ1在烟草表皮细胞、细胞核和内质网上能检测到荧光信号，证明PvJAZ1在细胞核和烟草表皮细胞内质网上表达。

图9 PvJAZ1的亚细胞定位

3 讨论与结论

TIFY家族已经在拟南芥、水稻和柳枝稷等物种中进行了全基因组鉴定和分析[4,29-30]，JAZ属于TIFY基因家族的JAZ亚家族成员，JAZ基因在植物生长发育和应激反应过程中发挥关键作用[31-33]。本研究从柳枝稷中克隆了PvJAZ1基因，PvJAZ1克隆全长为690 bp，该基因的开放阅读框全长为630 bp，编码209个氨基酸。结构域分析、序列多重比较分析、系统进化分析和模体分析表明PvJAZ1蛋白具有一定的保守性和同源性，这些都可以解释为它们同为禾本科植物，柳枝稷PvJAZ1基因也可能与它们具有功能相似性。

JAZ蛋白作为枢纽蛋白在植物生长发育和胁迫信号应答的调控过程中发挥关键作用[34-35]。研究表明水稻OsJAZ9抑制OsbHLH062和OsMYB30的表达，导致盐和耐寒性增加[12]；OsJAZ1依赖ABA和JA信号负调控水稻的耐旱性[14]。本研究通过启动子分析发现了与光响应、非生物胁迫响应、激素响应和生长发育响应相关的顺式作用元件，表明PvJAZ1可能参与多种激素信号途径，并参与调控柳枝稷的生长发育和逆境调控过程；qRT-PCR结果表明PvJAZ1在6种激素处理中对IAA的诱导反应最强烈，同时受到JA明显的抑制作用，并且在SA，Eth，GA和ABA的处理上有上调趋势，表明PvJAZ1可能参与柳枝稷IAA与JA信号的调控；PvJAZ1对盐胁迫与干旱胁迫反应强烈而对冷胁迫不敏感，这一结果同OsJAZ1的胁迫响应特性相似[14]。结合PvJAZ1的启动子分析和表达特性分析，PvJAZ1可能在柳枝稷JA信号转导途径及盐与干旱胁迫防御反应中发挥作用。

OsJAZ1是JA信号阻遏物，与假定的JA受体OsCOI1b相互作用，在小穗发育过程中触发OsJAZ1的降解；OsJAZ1还与JA信号传导途径中的转录因子OsMYC2相互作用，并抑制OsMYC2在激活OsMADS1中的作用，OsMADS1是对小穗发育至关重要的基因[16]。在组织特异性表达的分析中发现柳枝稷PvJAZ1在小穗中表达量极显著高于其它组织，结合以前的研究可以推测PvJAZ1可能参与调节小穗生长发育的生命进程，在花分生组织中具有重要作用。

有研究表明，OsJAZ9和OsJAZ10蛋白都定位在细胞核内[2,23,36]；OsJAZ1蛋白定位于细胞质，但在JA处理条件下定位于细胞核[14]；Cai等[37]通过双分子荧光互补试验证实OsJAZ1与MYC2在细胞核中进行互作[16]。GsTIFY10,GsTIFY11b,MaTIFY1等TIFY基因家族成员多定位在细胞核内[38-40]。本研究中烟草叶片瞬时表达GFP融合蛋白结果显示PvJAZ1定位烟草表皮细胞、细胞核和内质网上，这可能是该基因在细胞质和细胞核进行频繁交流的证据，其具体行使功能机制还需进一步探讨。

本研究从柳枝稷中克隆获得PvJAZ1的基因序列，并对其进行了生物信息学分析、表达特性分析以及亚细胞定位分析，初步确定PvJAZ1基因在柳枝稷响应JA信号以及盐和干旱胁迫中发挥功能，为柳枝稷PvJAZ1基因的功能研究奠定基础。