不同苜蓿的抗寒性差异及其与糖类物质含量的相关性研究

孙明雪， 张玉霞*， 丛百明， 王显国， 田永雷， 张庆昕， 杜晓艳

(1. 内蒙古民族大学农学院， 内蒙古 通辽 028041； 2. 内蒙古通辽市畜牧兽医科学研究所， 内蒙古 通辽 028000；3. 中国农业大学动物科技学院， 北京 100083； 4. 内蒙古自治区农牧业科学院， 内蒙古 呼和浩特 010010)

苜蓿(MedicagosativaL.)作为优良的高蛋白牧草在我国北方科尔沁沙地广泛种植，但由于此地区生存环境恶劣、冬季降水少、北风风力极大，经常出现持续性-25℃以下低温天气，致使苜蓿冻害严重，不能正常返青，进而严重影响生产效益[1]。国内外诸多学者探究苜蓿抗寒的生理生化机制，为培育高产抗寒苜蓿品种提供了有力的理论支持[2-5]，其中对糖类物质与苜蓿抗寒性相关性表明，可溶性糖具有渗透调节作用，是苜蓿抗寒保护物质[6-7]。亦有研究表明糖类物质中的葡萄糖、果糖、蔗糖和低聚合度的果聚糖均可能是抵抗低温胁迫的抗寒保护物质[8]，但关于苜蓿糖类物质与抗寒性关系的研究尚存在争议。Volenec[9]研究表明紫花苜蓿根部淀粉含量在秋冬季节呈下降趋势，而蔗糖含量升高，但赵宇光[10]试验结果表明可溶性总糖在野生黄花苜蓿和紫花苜蓿间的差异不显著，并不与种间的抗冻性呈正相关，Bush[11]也认为糖类物质在植物抗冻性中所扮演的角色不是很确定，在种间可能存在不同。为此，本试验在科尔沁典型沙化土地种植黄花苜蓿和4个紫花苜蓿品种，利用程序式低温处理箱进行低温处理，采用电导法协同Logistic回归方程计算苜蓿半数致死温度(LT50)，确定苜蓿耐寒阈值，通过LT50与苜蓿根颈糖类物质的相关性研究，分析苜蓿的抗寒性差异及其与糖类物质的相关性，为抗寒苜蓿品种的选育和安全越冬栽培技术调控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验区自然概况

试验地位于内蒙古民族大学科技园区，地理位置为北纬43°30′ N，东经122°27′ E。年平均气温5.5℃，≥10℃年积温为3 000～3 200℃，无霜期140～150 d，年平均降水量约375 mm，年平均风速3.0～4.4 m·s-1，土壤为沙壤土。沙壤土具有透气性较好、保水保肥抗旱能力较差、土温变幅较大等特点。

1.2 试验设计

试验采用随机区组设计，种植黄花苜蓿和4个紫花苜蓿主栽品种(‘骑士T’、‘北极熊’、‘草原3号’和‘巨能3010’)，每个处理设4次重复，共20个小区，小区面积4 m×5 m=20 m2，四周设保护行。于2019年7月15日播种，条播行距 15 cm，播种时一次性施入30，200，150 kg·hm-2(纯氮、P2O5、K2O)的氮、磷、钾肥，供试肥料为尿素(N 46.3%)、过磷酸钙(P2O514%)、钾肥为硫酸钾(K2O 50%)。灌溉方式为指针式喷灌。

于封冻期前(11月15日)挖取苜蓿越冬器官，4℃冰箱中储存备用。每个材料平均分成6份，每份30株苜蓿，装入干净的塑料袋中，其中1份作为对照(4℃)，其余5份放入程序式低温处理箱(温度误差为±1℃)进行分批低温处理。处理时采用脱脂棉包裹，加水适量，再用锡纸包裹，注明编号，低温处理温度分别为-10℃，-15℃，-20℃，-25℃和-30℃，按照4℃每小时的速率降温，到达设定温度后保持6 h，然后按照4℃每小时的速率升至4℃，取出置于冰箱4℃下保持12 h，测定苜蓿根颈相对电导率和糖类物质含量。

1.3 苜蓿材料来源

苜蓿材料来源见表1。

表1 苜蓿材料名称及来源

1.4 测定指标及方法

采用DDS-302电导率仪法测定电导率并计算相对电导率[12]；采用蒽酮比色法测定可溶性糖和淀粉含量[12]；采用二硝基水杨酸法和间苯二酚法测定蔗糖和果糖含量[13]。

1.5 数据分析

试验数据用Microsoft Excel软件处理、制作表格，SPSS 17.0软件进行方差显著性分析，采用Duncan检验方法进行多重比较，根据相对电导率拟合Logistic方程，并计算半致死温度(LT50)。

2 结果与分析

2.1 苜蓿的抗寒性差异及评价方法

如表2所示，随着胁迫温度的降低，苜蓿根颈的相对电导率呈增加趋势，其中‘骑士T’、‘北极熊’、‘巨能3010’和‘草原3号’紫花苜蓿品种根颈的相对电导率在-15℃处理开始较CK和-10℃处理显著增加(P<0.05)；黄花苜蓿在-20℃处理开始较CK,-10℃和-15℃处理增加显著(P<0.05)。进一步根据苜蓿根颈相对电导率结合Logistic回归分析，并计算苜蓿的半数致死温度，表明黄花苜蓿和4个紫花苜蓿抗寒能力排序为黄花苜蓿>‘北极熊’>‘草原3号’>‘巨能3010’>‘骑士T’。在-15℃处理下黄花苜蓿根颈相对电导率显著低于‘巨能3010’(P<0.05)，在-20℃处理下黄花苜蓿和‘北极熊’相对电导率显著低于‘骑士T’和‘巨能3010’(P<0.05)。

表2 低温胁迫苜蓿根颈相对电导率的变化及LT50值

2.2 低温胁迫下苜蓿根颈中可溶性糖类物质的变化

如表3所示，黄花苜蓿和4个紫花苜蓿品种根颈中可溶性糖含量随低温胁迫温度的降低呈先增加后降低的变化趋势，其中黄花苜蓿和‘北极熊’在不同低温处理下可溶性糖含量无显著性变化；‘骑士T’、‘草原3号’和‘巨能3010’分别在-20℃,-15℃和-10℃处理下可溶性糖含量达到最大值。-20℃处理下‘骑士T’苜蓿根颈的可溶性糖含量显著高于黄花苜蓿以外的其他紫花苜蓿品种(P<0.05)；-25℃,-30℃处理下‘巨能3010’苜蓿根颈的可溶性糖含量显著高于‘骑士T’紫花苜蓿品种(P<0.05)。

表3 低温胁迫对苜蓿根颈可溶性糖含量的变化

2.3 低温胁迫下苜蓿根颈中淀粉含量的变化

如表4所示黄花苜蓿和4个紫花苜蓿品种根颈淀粉含量受低温胁迫影响呈降低趋势。-25℃处理下黄花苜蓿和‘骑士T’根颈淀粉含量显著低于-10℃处理(P<0.05)；‘草原3号’和‘巨能3010’分别在-20℃和-15℃处理下根颈淀粉含量显著低于-10℃处理(P<0.05)；‘北极熊’在—30℃处理下根颈淀粉含量显著低于-10℃处理(P<0.05)。-10℃处理下‘巨能3010’根颈淀粉含量显著高于黄花苜蓿和‘北极熊’、‘草原3号’(P<0.05)，低温胁迫降低至-15℃和-20℃处理下，黄花苜蓿和4个紫花苜蓿品种间的淀粉含量无显著性差异。

表4 低温胁迫下苜蓿根颈淀粉含量的变化

2.4 低温胁迫下苜蓿根颈中果糖含量的变化

如表5所示，黄花苜蓿和4个紫花苜蓿品种随着低温胁迫的加剧根颈中果糖含量呈增加-降低-增加的双峰型变化趋势，除‘北极熊’紫花苜蓿品种外其他苜蓿在-10℃处理下较对照显著增加(P<0.05)。黄花苜蓿和‘骑士T’、‘草原3号’、‘巨能3010’紫花苜蓿在-25℃处理下最低，‘北极熊’在-20℃处理果糖含量最低；黄花苜蓿和4个紫花苜蓿品种在—30℃处理下出现第二峰，黄花苜蓿和‘北极熊’较最低值显著增加(P<0.05)。-10℃处理下黄花苜蓿根颈果糖含量显著高于4个紫花苜蓿(P<0.05)；-20℃和-25℃处理下黄花苜蓿和‘草原3号’果糖含量显著高于‘骑士T’(P<0.05)，—30℃处理下黄花苜蓿和‘北极熊’果糖含量显著高于‘骑士T’和‘巨能3010’(P<0.05)。

表5 低温胁迫下苜蓿根颈果糖含量的变化

2.5 低温胁迫下苜蓿根颈中蔗糖含量的变化

如表6所示，黄花苜蓿和4个紫花苜蓿根颈中蔗糖含量随温度胁迫的降低呈增加-降低-增加的双峰型趋势。除黄花苜蓿和‘北极熊’外在-15℃处理下其他品种根颈蔗糖含量较-10℃处理下显著降低(P<0.05)，-20℃及更低温度处理根颈中蔗糖含量呈增加再降低的趋势，黄花苜蓿和‘草原3号’较-15℃增加显著(P<0.05)。-25℃和—30℃处理下黄花苜蓿和‘北极熊’根颈淀粉含量显著高于‘骑士T’和‘巨能3010’(P<0.05)，-20℃和-25℃处理下‘草原3号’和黄花苜蓿根颈淀粉含量显著高于‘骑士T’和‘巨能3010’(P<0.05)。

2.6 苜蓿根颈中糖类物质含量与LT50间的相关性分析

如表7所示,沙化草地-20℃处理下苜蓿根颈中淀粉含量与LT50呈极显著正相关(P<0.01)，说明此温度下测定苜蓿根颈中淀粉含量较高的品种，LT50越高，抗寒能力越差。-20℃温度处理下果糖和蔗糖含量与其LT50呈显著负相关(P<0.05)，且果糖和蔗糖在—30℃处理与其LT50呈极显著负相关(P<0.01)，果糖在-25℃处理与其LT50呈极显著负相关(P<0.01)。说明-20℃及以下温度下果糖和蔗糖含量较高的苜蓿品种，抗寒能力越强。

表7 半致死温度与苜蓿根颈中糖类物质的相关性

3 讨论

Lyons[14]认为，当植物受到低温胁迫时，细胞膜的透性会增大，电解质会不同程度的渗漏，导致细胞膜系统损坏。抗寒性较强品种的细胞在一定范围内不但能耐受低温伤害，而且渗透性的变化可以逆转，当温度回升时，细胞就能恢复正常。反之，抗寒性弱品种的细胞损伤不仅不能恢复正常甚至会造成死亡[14]。本试验研究在-15℃处理下苜蓿根颈相对电导率值增加显著，且各品种间出现差异，其中黄花苜蓿和‘北极熊’的相对电导率值显著低于其他3个紫花苜蓿品种，说明其这两个品种的苜蓿细胞膜透性小于其他苜蓿品种，电解质渗漏较少，即细胞膜遭受破坏程度较轻，从而能说明黄花苜蓿和‘北极熊’抗寒能力较强。

低温环境植物体内会积累大量糖类物质起到渗透调节作用，提高细胞的渗透势，保护细胞的稳定性以缓解其受到的伤害[15]。有研究表明可溶性糖还可以与细胞膜发生反应达到保护细胞膜、原生质及细胞器的作用[16]。乔洁等[17]研究表明可溶性糖含量是衡量苜蓿抗寒性强弱的鉴定指标之一。本研究表明，黄花苜蓿和4个紫花苜蓿品种根颈中可溶性糖含量随着温度胁迫的降低呈增加-降低-增加的双峰型趋势，变化规律明显，但低温处理下苜蓿根颈中可溶性糖含量与其LT50无显著性相关，说明苜蓿根颈中可溶性糖的积累量与其抗寒能力强弱无明显关系，这与崔国文[18]的研究结果一致。

低温胁迫下水解酶活性提升，导致大量淀粉快速分解为可溶性糖，提升细胞液浓度，通过减缓其水分流失和降低冰点增强其抗寒能力[19]。本研究表明黄花苜蓿和4个紫花苜蓿品种根颈中淀粉含量随着胁迫温度的降低呈降低的趋势，相关分析表明-20℃处理下苜蓿根颈淀粉含量越高则抗寒能力越弱，Castonguay等[20]研究表明淀粉在越冬期间分解转化成可溶性糖，从而提高苜蓿的抗寒性，与本文研究结果一致。

韩文军[21]和郝培彤[22]研究结果表明与苜蓿抗寒性有一定相关性的是碳水化合物中蔗糖和果糖含量。果糖、蔗糖和葡萄糖总称为可溶性糖，而可溶性糖在植物抗寒方面起着重要作用。有研究表明，这些糖类不仅可以作为渗透调节物质调节细胞渗透势，果糖还可以作为单糖发生磷酸化，从而引起糖信号传递使细胞对低温作出反应[23]。本试验研究表明黄花苜蓿和4个紫花苜蓿品种随着低温胁迫的加剧根颈中果糖含量呈增加-降低-增加的趋势。黄花苜蓿和4个紫花苜蓿品种根颈中蔗糖含量随着温度胁迫的降低变化规律不一致。相关分析表明-20℃及更低温度处理下果糖和蔗糖含量与其LT50呈显著负相关，说明低温处理下积累果糖和蔗糖含量有利于提高苜蓿抗寒能力。可溶性糖类中的其他糖类，如棉子糖、水苏糖等寡糖类的积累是否与苜蓿抗寒能力有关以及该糖类物质对苜蓿低温胁迫的响应机制是如何还有待进一步研究。

4 结论

综上所述，低温处理下相对电导率拟合Logistic回归方程计算苜蓿半数致死温度，得出苜蓿抗寒性排序为黄花苜蓿>‘北极熊’>‘草原3号’>‘巨能3010’>‘骑士T’。-20℃处理下苜蓿根颈中淀粉含量、-20℃及以下低温处理下果糖和蔗糖含量可以作为苜蓿衡量抗寒性强弱的敏感指标，果糖和蔗糖是苜蓿越冬抗寒保护物质。