秋末刈割对沙地苜蓿冬季根颈抗氧化酶活性及脯氨酸含量的影响

朱爱民， 张玉霞， 王显国， 田永雷

(1. 内蒙古民族大学， 内蒙古通辽 028041； 2. 中国农业大学动物科技学院，北京 100083)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)作为优质的多年生豆科牧草(Leguminosaesp.)[1]，在我国生态环境建设和畜牧业生产中发挥着重要作用[2]。科尔沁地区在气温较低的年份紫花苜蓿普遍有冻害现象，直接制约该地区苜蓿产业的发展。国内外有关苜蓿抗寒方面的研究资料[3-8]很多，研究表明紫花苜蓿抗寒能力的大小与其根系中保护酶活性密切相关[9-10]，过氧化物酶(peroxidase，POD)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)是酶促防御系统的重要保护酶类，对于维护细胞膜系统的稳定性具有重要作用，对苜蓿抗寒力的提高有特殊意义[11-13]，其活性的变化可作为植物的耐寒指标[14-16]。

刈割是人工草地有效利用的重要措施之一，合理刈割对苜蓿的安全越冬和再生具有重要意义[17]，刈割与苜蓿根系特征[18-19]及根颈氧化酶活性关系密切，有学者如Silkett[20]、Grand-field[21]、Jackobs[22]等认为第一次杀霜(杀霜日是指气温首次降至-20C )之前4～6周，是中、高维度地区紫花苜蓿刈割秋季敏感期。在该时段刈割紫花苜蓿导致草地持久性和随后年份草产量降低。但Reynolds[23]、Mays等[24]认为当苜蓿品种秋眠和抗病性强、土壤肥力高、刈割次数和生育时期(或间隔期)适宜，秋季刈割不会造成草地持久性和产草量降低。有关刈割的争议，究竟孰是孰非，需要更多的研究去佐证。孙浩等[25]在2015年对阿鲁科尔沁旗最佳末次刈割期研究中表明，末茬秋季敏感期刈割导致苜蓿越冬率将低，但未对苜蓿根颈中抗氧化物酶活性和渗透调节物质变化做深入研究，苜蓿根颈中抗氧化物酶活性在植物越冬期间存在怎样的变化规律及与越冬有无直接联系还需进一步探究。

本试验通过在科尔沁地区对8个苜蓿品种秋季敏感两时期刈割处理同未刈割对照，探究苜蓿根颈中抗氧化物酶活性及游离脯氨酸变化，分析科尔沁沙地秋末是否应该刈割及最佳刈割时期，为解决科尔沁沙地苜蓿末茬刈割及越冬问题提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验区自然概况

试验地设在内蒙古自治区赤峰市阿鲁科尔沁旗草源合作社公司，地理位置东经116°21′～120°58′，北纬41°17′～45°24′，温带半干旱大陆性气候。年平均气温0～6℃，≥10℃积温3 000～3 200℃，无霜期140～150天，年平均降水量350～400 mm，蒸发量是降水量的5倍左右，年平均风速3～4.4 m·s-1。试验田土壤为沙土，新开垦草地。

1.2 试验材料

供试材料如表1所示。

1.3 试验方法

小区布局及管理：采用随机区组设计，小区试验面积20m2(5m×4m)，8个品种，3次重复，共设24个小区，小区之间设50 cm过道。所有小区底肥均施750 kg·hm-2安琪有机肥、300 kg·hm-2过磷酸钙、7 kg·hm-2硫酸钾、60 kg·hm-2尿素(机施)，播量22.5 kg·hm-2，8月4日播种，人工撒播，试验田正常管理。

表1 紫花苜蓿品种及来源Table 1 Alfalfa varieties and sources

刈割处理：分别于10月1号和10月15号两秋季敏感期对每小区4 m×1.5 m进行刈割并标记，未刈割作为对照。

取样时期：分别于土壤冻融交替时期(秋冬晚上温度低于0℃土壤冻结与白天温度大于0℃，土壤冻融交替出现的时期)、土壤封冻期(冬季全天温度低于0℃，土壤完全冻结的时期)取样，并测定相关指标。

1.4 测定项目及方法

每处理随机挖取长势良好且根颈粗度一致的紫花苜蓿根系30株，于实验室中用蒸馏水冲洗干净后用滤纸吸出根系表面的水分，用刀片对根颈部进行切片、备用，进行试验：游离脯氨酸用茚三酮法测定；丙二醛用硫代巴比妥酸法测定；POD用愈创木酚法测定；SOD用氮蓝四唑法测定；CAT用紫外吸收法测定。

1.5 数据分析

试验数据用Microsoft Excel 软件处理并做表格，SPSS 17.0软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 秋末刈割处理对8个苜蓿品种根颈中SOD活性的影响

根据表2可知，土壤冻融交替期，未刈割苜蓿根颈中SOD活性显著高与10月1号刈割苜蓿根颈中SOD活性(P<0.05)，除‘龙牧801’和‘公农1号’品种外未刈割苜蓿根颈中SOD活性显著高于10月15号刈割苜蓿根颈中SOD活性(P<0.05)。10月15号刈割的苜蓿根颈中SOD活性均显著高于10月1号刈割的根颈中SOD活性。不同时期刈割苜蓿不同品种间根颈中SOD活性强度不同：未刈割和10月15号刈割，‘龙牧801’、‘农菁1号’、‘农菁8号’苜蓿根颈中SOD活性显著高于其他品种(P<0.05)；10月1号刈割，‘龙牧801’、‘东苜1号’、‘公农号’和‘农菁1号’根颈中SOD活性显著高于其他品种(P<0.05)；无论是未刈割还是不同时期刈割‘草原2号’品种苜蓿根颈中SOD活性与其他品种相比较弱。

土壤封冻期，未刈割苜蓿根颈中SOD活性均显著高于不同时期刈割苜蓿根颈中SOD活性(P<0.05)，10月15号刈割的苜蓿根颈中SOD活性高于10月1号刈割苜蓿根颈中SOD活性，但是只有‘东苜1号’、‘公农1号’、‘农菁1号’、‘农菁8号’SOD活性变化达到显著水平(P<0.05)。不同品种间根颈中SOD活性有明显差异：未刈割‘农菁8号’苜蓿根颈中SOD活性显著低于其他品种(P<0.05)；10月1号刈割，‘肇东’、‘草原2号’及‘公农1号’苜蓿根颈中SOD活性显著高于其他品种(P<0.05)，‘农菁8号’品种根颈中SOD活性最低；10月15号刈割，公农一号苜蓿根颈中SOD活性最强，且显著高于其他苜蓿品种(P<0.05)，‘农菁1号’和‘草原3号’品种根颈中SOD活性显著低于其他品种(P<0.05)。

表2 刈割处理对8个苜蓿品种根颈中SOD活性的影响Table 2 Effect of cutting on the activity of SOD in the root neck of 8 alfalfa varieties/ U·g-1 FW

注：不同小写字母表示差异显著性水平P< 0.05，“/”左边表示同列相同时期测定不同苜蓿品种间差异显著性，右边表示同一品种刈割处理差异显著性，下同

Note: The different letters indicate significant differences at the 0.05 level, On the left side of‘/’ indicate significant difference of the same column among different alfalfa varieties that determined at the same time ,On the right side of‘/’ indicate significant difference of the same variety betwen cutting treatments. The same as below

2.2 秋末刈割处理对8个苜蓿品种根颈中POD活性的影响

由表3可知，秋末不同时期刈割处理对8个苜蓿品种根颈中POD活性影响不同，不同苜蓿品种间根颈中POD活性强度不同。

土壤冻融交替期，10月1号刈割苜蓿根颈中POD活性均显著高于未刈割和10月15号刈割根颈中POD活性(P<0.05)；未刈割苜蓿根颈中POD活性均显著高于10月15号刈割根颈中POD活性(P<0.05)。未刈割苜蓿，‘公农1号’根颈中POD活性显著高于其他品种(P<0.05)；10月1号刈割和10月15号刈割‘公农1号’、‘东苜1号’根颈中POD活性均显著高于其他品种(P<0.05)。

土壤封冻期，未刈割苜蓿根颈中POD活性显著高于不同时期刈割苜蓿根颈中POD含量(P<0.05)；10月1号刈割除‘农菁1号’和‘农菁8号’外其他苜蓿根颈中POD活性均显著高于10月15号刈割根颈中POD含量(P<0.05)。未刈割‘农菁1号’、‘农菁8号’、‘东苜1号’苜蓿根颈中POD活性显著高于其他品种(P<0.05)；10月1号刈割‘东苜1号’苜蓿根颈中POD活性显著高于其他品种(P<0.05)；10月15号刈割‘农菁1号’、‘农菁8号’根颈中POD活性显著高于其他品种(P<0.05)；无论未刈割还是不同时期刈割‘龙牧801’和‘草原3号’根颈中POD含量均显著低于其他苜蓿品种(P<0.05)。

表3 刈割处理对8个苜蓿品种根颈中POD活性的影响Table 3 Effect of cutting on the activity of POD in the root neck of 8 alfalfa varieties/ U·min-1·g-1 FW

2.3 秋末刈割处理对8个苜蓿品种根颈中CAT活性的影响

根据表4可知，土壤冻融交替期测定结果表明未刈割与不同时期刈割苜蓿根颈中CAT活性均无显著性差异。未刈割、10月1号刈割、10月15号刈割‘龙牧801’苜蓿根颈中CAT活性均是最高，与其他品种比较差异显著(P<0.05)，无论是未刈割还是不同时期刈割‘农菁8号’苜蓿根颈中CAT活性均较弱。

土壤封冻期，10月1号刈割苜蓿根颈中CAT活性显著高于未刈割和10月15号刈割苜蓿根颈中CAT活性(P<0.05)，除‘公农1号’外未刈割苜蓿根颈中CAT活性均显著高于10月15号刈割苜蓿根颈中CAT活性(P<0.05)。未刈割‘东苜1号’、‘草原2号’苜蓿根颈中CAT活性显著高于其它苜蓿品种(P<0.05)，草原3号苜蓿根系中CAT活性显著低于其他苜蓿品种(P<0.05)；10月1号刈割‘肇东’、‘草原2号’苜蓿根颈中CAT活性显著高于其他品种(P<0.05)，‘农菁8号’苜蓿根颈中CAT活性显著低于其他品种(P<0.05)；10月15号刈割‘公农1号’品种根颈中CAT活性显著高于其他品种(P<0.05)，‘草原3号’苜蓿根颈中CAT活性最弱，与其他品种相比，差异性显著(P<0.05)。

表4 刈割处理对8个苜蓿品种根颈中CAT活性的影响Table 4 Effect of cutting on the activity of CAT in the root neck of 8 alfalfa varieties/ U·min-1·g-1 FW

2.4 秋末刈割处理对8个苜蓿品种根颈中丙二醛含量的影响

由表5可知，土壤冻融交替期，10月1号刈割苜蓿根颈中丙二醛含量显著高于10月15号刈割苜蓿根颈中MDA含量(P<0.05)，与未刈割苜蓿相比除‘肇东’、‘公农1号’品种外其他品种MDA含量均显著增加(P<0.05)。未刈割苜蓿根颈中MDA含量高于10月15号刈割苜蓿根颈中MDA含量，但只有‘肇东’和‘公农1号’苜蓿根颈中MDA含量变化达到显著水平(P<0.05)。未刈割‘农菁8号’苜蓿根颈中MDA含量显著高于其他苜蓿品种(P<0.05)；10月1号刈割‘农菁8号’、‘草原3号’和‘龙牧801’根颈中MDA含量显著高于其他品种(P<0.05)；10月15号刈割‘农菁1号’、‘农菁8号’及‘龙牧801’苜蓿根颈中MDA含量显著高于其他品种(P<0.05)；未刈割10月1号刈割及10月15号刈割根颈中MDA含量最低的苜蓿品种分别是‘东苜1号’、‘公农1号’、‘肇东’(P<0.05)。

土壤封冻期，未刈割苜蓿根颈中MDA含量显著高于10月1号刈割苜蓿根颈中MDA含量(P<0.05)，与10月15号刈割相比苜蓿根颈中MDA含量变化不显著。10月15号刈割苜蓿根颈中MDA含量显著高于10月1号刈割根颈中MDA含量(P<0.05)。未刈割和10月15号刈割‘农菁1号’、‘农菁8号’、‘草原2号’苜蓿根颈中MDA含量显著高于其他品种(P<0.05)；10月1号刈割‘农菁1号’、‘农菁8号’、‘草原2号’、‘草原3号’苜蓿根颈中MDA含量显著高于其他品种(P<0.05)；未刈割与不同时期刈割肇东和东苜1号苜蓿根颈中MDA含量相比其他品种显著降低(P<0.05)；

表5 刈割处理对8个苜蓿品种根颈中MDA含量的影响Table 5 Effect of cutting on the content of MDA in the root neck of 8 alfalfa varieties/ nmol.ml-1FW

2.5 秋末刈割处理对8个苜蓿品种根颈中游离脯氨酸含量的影响

土壤冻融交替期测定结果表明，如表6所示，未刈割苜蓿根颈中游离脯氨酸含量显著高于10月1号刈割和10月15刈割苜蓿根颈中含量(P<0.05)。10月1号刈割苜蓿根颈游离脯氨酸含量高于10月15号刈割苜蓿根颈中含量，但只有‘农菁1号’和‘农菁8号’苜蓿根颈中游离脯氨酸含量变化达到显著差异水平(P<0.05)。不同品种间未刈割、10月1号刈割和10月15号刈割根颈中游离脯氨酸含量最高的分别是‘东苜1号’、‘龙牧801’、‘龙牧801’，含量最低的分别是‘草原2号’、‘农菁1号’、‘农菁1号’。

土壤封冻期，未刈割苜蓿根颈中游离脯氨酸含量显著高于10月1号刈割苜蓿根颈中脯氨酸含量(P<0.05)，与10月15号刈割相比仅‘草原2号’和‘草原3号’差异达到显著水平(P<0.05)；10月1号刈割苜蓿根颈中游离脯氨酸含量除‘草原2号’和‘草原3号’外其他品种均显著低于10月15号刈割根颈中脯氨酸含量(P<0.05)。未刈割‘肇东’苜蓿根颈中游离脯氨酸含量显著高于其他苜蓿品种(P<0.05)；10月1号刈割‘肇东’、‘公农1号’苜蓿根颈中游离脯氨酸含量显著高于其他苜蓿品种(P<0.05)；10月15号刈割‘龙牧801’、‘肇东’、‘东苜1号’苜蓿根颈中游离脯氨酸含量较其他苜蓿品种高，差异显著(P<0.05)；未刈割、10月1号刈割和10月15号刈割根颈中游离脯氨酸含量最低的分别是‘草原3号’、‘农菁8号’和‘草原2号’。

表6 刈割处理对8个苜蓿品种根颈中游离脯氨酸含量的影响Table 6 Effect of cutting treatment on free proline content in root neck of 8 alfalfa varieties/ μg·g-1 FW

3 讨论与结论

3.1 秋末刈割处理对沙地苜蓿根颈中抗氧化酶活性的影响

研究表明逆境胁迫因素可诱发植物组织细胞内产生过量的H2O2等活性氧(reactive oxygen species，ROS)。ROS 过剩积累会造成膜系统、蛋白质和 DNA 分子结构等损伤。为抵御 ROS 对细胞的毒害，植物细胞便启动一些活性氧清除机制[26]，SOD、POD、CAT 是植物体内清除过量活性氧的重要酶促防御系统，可减轻或避免植物体的氧化损伤，抗寒性和耐刈割苜蓿品种在逆境条件下能维持较高的SOD、CAT 和 POD 等酶的活性，以利于清除超氧阴离子，降低膜质过氧化水平，从而减轻膜伤害程度[27]。季杨[28]等研究表明在逆境条件下鸭矛根系中SOD、POD酶活性增强。本试验研究表明，刈割后紫花苜蓿根颈中SOD活性较未刈割均明显减弱，推测刈割后苜蓿的抗逆性减弱。土壤冻融交替期，10月1号刈割苜蓿根颈中POD活性显著大于未刈割和10月15号刈割根颈中POD活性，可能由于取样测定时间和刈割时间长短有关，10月1号刈割后当白昼温度大于5℃时苜蓿仍继续再生，根系中POD活性逐渐增强，10月15号刈割距测定时期较短，昼夜温度逐渐降低，苜蓿进入休眠，苜蓿根颈中POD活性下降。土壤封冻期，未刈割苜蓿根颈中POD活性显著高于不同时期刈割苜蓿根颈中POD活性，土壤封冻后苜蓿根系已进入休眠状态，根颈中各物质处于稳定状态，此时未刈割苜蓿根颈中POD活性强，推断未刈割苜蓿抗寒性强于不同时期刈割苜蓿。谭淑端等[29]研究表明，持续逆境胁迫下双穗雀稗根系POD活性持续增加，刘建新[30]等研究表明，逆境胁迫下燕麦叶片中SOD、POD、CAT活性显著增加。本试验中，土壤冻融交替期，未刈割和不同时期刈割苜蓿根颈中CAT活性无显著差异；土壤封冻期，10月1号刈割苜蓿根颈中CAT活性显著高于未刈割和10月15号刈割苜蓿根颈中CAT活性，出现这种差异的原因是由于土壤封冻期温度昼夜均低于0℃，刈割和低温双重因素导致苜蓿根系中产生大量超氧阴离子，从而诱导苜蓿启动CAT保护机制，根系中CAT活性显著增加，协同SOD和POD作用将超氧阴离子分解为H2O和O2。这与彭淼等[31]研究一致，其研究表明SOD 作为抵御活性氧伤害的“第一道防线”能使 O2发生歧化作用而转化为H2O2，而 SOD 与H2O2清除酶 POD 和 CAT 的平衡对维持细胞功能至关重要，一般认为，其协调作用使细胞内活性氧维持在较低的水平。

3.2 秋末刈割处理对沙地苜蓿根颈中MDA含量的影响

丙二醛能抑制细胞保护酶的活性和降低抗氧化物的含量，是膜质过氧化的最终分解产物[32]。许多研究都将MDA含量作为衡量植物耐旱性强弱的一个重要指标[33-35]，张红萍等[36]研究指出随着逆境条件的加剧，丙二醛的含量也会逐渐增加。本试验与其研究结果一致，土壤冻融期，10月1号刈割苜蓿根颈中MDA含量大于未刈割苜蓿根颈中含量，且均显著大于10月15号刈割苜蓿根系中含量，这可能与苜蓿刈割后根颈抗逆性下降，苜蓿根颈细胞膜脂过氧化有关。土壤封冻期，10月1号刈割由于苜蓿根颈中CAT活性显著增强，协同SOD、POD共同作用清除自由基，所以此时测得MDA含量显著降低；10月15号刈割后随着温度的降低苜蓿进入休眠，此时根颈中物质含量维持在较稳定的范围，所以土壤封冻期测得苜蓿根系中MDA含量与未刈割根颈中含量相比无差异显著性。

3.3 秋末刈割处理对沙地苜蓿根颈中游离脯氨酸含量的影响

目前针对脯氨酸的积累与抗寒性是否相关还存在争议，有些学者认为逆境环境下植物体内脯氨酸的积累是其对逆境环境的适应反应[37]，但有学者认为脯氨酸的积累是由逆境胁迫造成的伤害结果[38]，本试验表明土壤冻融交替期和土壤封冻期，未刈割苜蓿根颈中游离脯氨酸含量均高于不同时期刈割根颈中含量。未刈割较刈割苜蓿受逆境胁迫小，而游离脯氨酸含量反而增加，所以推断逆境条件下植物体内脯氨酸的积累是其对逆境的适应反应，且未刈割苜蓿较刈割苜蓿适应低温胁迫能力强。

本研究初步结论为：进入寒冬，刈割与未刈割相比，未刈割苜蓿根颈中SOD、POD活性增强，游离脯氨酸含量增加，适应低温环境能力强，秋末敏感期刈割刺激苜蓿根颈中CAT活性增强，但SOD、POD活性较低，游离脯氨酸含量下降，适应低温环境能力弱，因此不建议秋末敏感期刈割。