黄芪三七合剂质量标准研究*

张仕瑾 ，兰 杨 ，王娅俐 ，赵茂林 ，郭廷东 ，张 燕 ，唐志立 ，谢席胜

（1. 川北医学院第二临床医学院·四川省南充市中心医院药学部·个体化药物治疗南充市重点实验室，四川 南充 637000； 2. 川北医学院医学影像学院，四川 南充 637100 3. 川北医学院第二临床医学院·四川省南充市中心医院肾内科，四川 南充 637000）

黄芪三七合剂是根据川北医学院第二临床医学院肾内科谢席胜主任医师临床验方开发的院内制剂，由黄芪、三七、当归、牛膝、昆布、薏苡仁、山药、甘草等中药组方，有益气养血、活血利水、健脾助运之功效，临床主要用于改善3-4 期慢性肾脏病患者的临床症状，延缓其病情向终末期发展。前期研究发现，黄芪三七复方能降低尿蛋白水平，调节血脂，改善高凝血状态，调节血清白蛋白水平及免疫状态，继而延缓病情进展，提高慢性肾脏病患者的生存质量［1-2］。汤剂煎煮烦琐，携带、储藏不便，且口感差，患者依从性差。为此，本课题组在不改变原方汤剂的物质基础上将其开发成合剂，并在前期完成了黄芪三七合剂制备工艺研究。为有效控制其质量，本研究中拟对制剂中黄芪、三七、当归进行定性鉴别，并对其中有效成分人参皂苷Rg1进行含量测定，以建立该制剂的质量标准。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20AT 型高效液相色谱仪（日本Shimadzu 公司）；MS105DU 型电子分析天平（梅特勒-托利多国际有限公司）；JY10002 型电子分析天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；TGL-16M 型台式高速冷冻离心机（济南鑫贝西生物技术有限公司）；KQ-250V 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；UPH-1V-20T 型超纯水制造系统（四川优普超纯科技有限公司）。

1.2 试药

黄芪三七合剂（南充市中心医院制剂室，批号分别为 0224，0225，0226）；当归对照药材（批号为 120927-201617），人参皂苷 Rg1对照品（批号为 110703-201832，含量为 92.4% ），黄芪甲苷对照品（批号为110781-201717，含量为 96.9% ），三七皂苷 R1对照品（批号为 110745-201820，含量为 93.1%），均购自中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 定性鉴别

当归：取样品50 mL，乙醚振摇提取2 次，每次40 mL，水相留存备用，合并有机相，水浴蒸干，加甲醇2 mL 溶解固形物，作为供试品溶液。按黄芪三七合剂处方和工艺制备缺当归的阴性样品，同法制得缺当归的阴性对照品溶液。另取当归对照药材0.5 g，用20 mL 乙醚超声（功率250 W，频率40 kHz）提取10 min，提取液滤过，水浴蒸干，加甲醇1 mL 溶解固形物，作为对照药材溶液。按 2015 年版《中国药典（四部）》通则 0502“薄层色谱法”项下方法，分别吸取上述 3 种溶液 5 ～ 10 μL，点于同一硅胶 G 板上，以环己烷 - 乙酸乙酯（3 ∶1，V ／ V）为展开剂，展开前预饱和20 min，待展距约8 cm 时，取出，挥干溶剂，在紫外灯（365 nm）下检视。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置处显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。见图1 A。

黄芪：取当归鉴别项下水相，乙酸乙酯洗涤2 次（每次40 mL），水相用水饱和正丁醇萃取2 次（每次40 mL），合并上层溶液，氨试液洗涤2 次（每次20 mL），水浴蒸干，加甲醇1 mL 溶解固形物，作为供试品溶液。按黄芪三七合剂处方和工艺制备缺黄芪的阴性样品，同法制得阴性对照品溶液。另取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成1 mg／mL 的对照品溶液。按2015 年版《中国药典（四部）》通则0502“薄层色谱法”项下方法，分别吸取上述3 种溶液5 ～10 μL，点于同一硅胶G 板上，以三氯甲烷-甲醇 - 水（13 ∶7 ∶2，V ／ V ／ V）2 ～ 10 ℃放置 12 h 以上的下层溶液为展开剂，展开前预饱和20 min，待展距约10 cm时，取出，挥干溶剂，喷以10%硫酸乙醇溶液，加热至斑点清晰。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置处显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。见图1 B。

三七：以黄芪鉴别项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液。按黄芪三七合剂处方和工艺制备缺三七的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。另取三七皂苷R1对照品适量，加甲醇制成1 mg／mL 的对照品溶液。后续操作同黄芪鉴别项下。结果供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置处显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。见图1 C。

黄芪、三七：由于黄芪甲苷和三七皂苷均属三萜皂苷，结构相似。在同一展开系统中斑点清晰，分离度较好。为方便操作，将两者采用同一展开系统同时进行鉴别。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置处显相同颜色的斑点，各斑点分离度好。见图1 D。

2.2 人参皂苷Rg1 含量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Shimadzu C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈 - 水（19 ∶81，V ／ V）；流速：1 mL ／min；检测波长：203 nm；柱温：35 ℃；进样量：10 μL。

2.2.2 溶液制备

取人参皂苷Rg1对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度为 445 μg ／mL 的对照品贮备液，稀释 10 倍，制成质量浓度为44.5 μg／mL 的对照品溶液。精密吸取摇匀后的样品（批号为 0224）2 mL，置 25 mL 容量瓶中，用75% 甲醇定容，10 ℃ 下，6 000 r／min 离心 10 min，取上清液，经 0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按黄芪三七合剂处方和工艺制备缺三七的阴性样品，同法制得阴性对照品溶液。

2.2.3 方法学考察

专属性试验：精密吸取 2.2.2 项下 3 种溶液各 10μL，按2.2.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图，见图2。结果在与对照品溶液色谱相同保留时间处阴性对照品溶液色谱无干扰峰，表明专属性良好。

线性关系、检测限（LOD）和定量限（LOQ）考察：分别精密吸取对照品贮备液适量，加甲醇稀释成质量浓 度 分 别 为 17.80，26.70，35.600，44.50，66.75，89.00 μg ／mL 的溶液，按 2.2.1 项下色谱条件进样测定。以人参皂苷 Rg1峰面积（Y）为纵坐标、质量浓度（X，μg ／ mL）为横坐标进行线性回归，得回归方程Y ＝ 3 332.2 X-11 443（R2＝ 0.999 7，n ＝ 6）。结果表明，人参皂苷 Rg1质量浓度在 17.80 ～89.00 μg ／mL 范围内与峰面积线性关系良好。以3 倍信噪比对应的检测水平计算，得 LOD 为 3.9 μg ／mL，以 10 倍信噪比对应的检测水平计算，得 LOQ 为 5.0 μg ／mL。

精密度试验：精密吸取2.2.2 项下对照品溶液10μL，按2.2.1 项下色谱条件重复进样6 次，记录峰面积。结果的 RSD 为 1.13%（n ＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一批（批号为0224）样品，依法制备供试品溶液，室温下分别于 0，2，4，6，8，10，24 h 时进样测定。结果峰面积的 RSD 为 1.68% （n ＝ 7），表明供试品溶液室温放置24 h 内基本稳定。

重复性试验：取同一批（批号为0224）样品，按2.2.2 项下方法制备供试品溶液，按 2.2.1 项下色谱条件连续进样6 次，测定。结果峰面积的 RSD 为1.42%（n ＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：精密吸取已知含量（0.565 1 mg／mL）的样品1 mL，置25 mL 容量瓶中，平行6 份，分别精密加入对照品溶液（1.212 4 mg ／mL）0.5 mL，按 2.2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.2.1 项下色谱条件进样测定。结果见表1。

2.2.4 样品含量测定

取 3 批（批号分别为 0224，0225，0226）样品各适量，按 2.2.2 项下方法制备供试品溶液，再按 2.2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算样品含量。结果 3 批样品人参皂苷 Rg1平均含量分别为0.590 7，0.571 0，0.565 4 mg ／mL。

3 讨论

3.1 展开剂选择

在黄芪薄层鉴别预试验过程中尝试了多种不同展开系统，结果阴性样品始终存在干扰。进一步试验发现，由于黄芪甲苷和人参皂苷Rg1两者均为三萜皂苷类成分，极性相似，未能分离，故在阴性样品中存在人参皂苷Rg1干扰现象。参考文献［3］中黄芪甲苷与人参皂苷Rg1的分离方法，未能得到较好的结果。多次尝试后发现，将三氯甲烷 - 甲醇 - 水（13 ∶7 ∶2，V ／ V ／ V）2 ～ 10 ℃ 放置12 h 以上的下层溶液作为展开剂，能较好地分离黄芪甲苷、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1等3 种结构类似化合物。为方便操作，特将黄芪与三七在同一薄层板上进行鉴别。结果色谱斑点清晰、分离度好，可为含有黄芪、三七的复方制剂的理化鉴别提供参考。

3.2 含量测定

前期基础研究发现，黄芪三七合剂可延缓模型大鼠肾纤维化进程，抑制肾小管上皮细胞转分化，并有一定抗氧化应激作用；同时研究证实，三七总皂苷中人参皂苷Rg1对糖尿病肾病模型大鼠肾功能指标具有一定改善作用［4］。其机制是通过减少细胞自噬和活性氧的产生，抑制氧化应激途径，从而对醛固酮诱导致损的肾小管上皮细胞产生良好的保护作用［5］。因此，人参皂苷Rg1是本方的主要有效成分之一，故选择人参皂苷Rg1作为本制剂质量控制的指标成分。试验过程中考察了处理样品的不同溶剂（甲醇、75%甲醇、50%甲醇、乙醇、75%乙醇、50%乙醇）对人参皂苷Rg1含量测定的影响。结果经75%甲醇处理后含量相对较高，同时易于滤过，故选用75%甲醇处理样品。此外，还考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸水系统，结果以乙腈-水为流动相时，供试品溶液色谱峰峰形较好，分离度大于1.5，理论板数大于 6 000，拖尾因子在 0.95 ～ 1.10 之间。

3.3 方法评价

黄芪三七合剂临床主要用于治疗3-4 期慢性肾脏病，具有益气养血、活血利水、健脾助运的功效，能使气血健旺、瘀血消散，从而恢复部分肾脏功能。本试验中建立了黄芪三七合剂中君药黄芪，臣药三七、当归的定性鉴别及主要有效成分人参皂苷Rg1的含量测定方法，经方法学验证，所建立的方法精密度高，重复性好，稳定可靠，可用于黄芪三七合剂的质量控制。