复方连翘滴鼻液制备工艺优化及质量控制

2021-04-08金伟华于波涛蒲志强

中国药业 2021年6期

金伟华，于波涛，张明，蒲志强，龚婵

（1. 中国人民解放军西部战区总医院药剂科，四川成都 610083； 2. 川北医学院药学部，四川南充 637000）

连翘为木犀科植物连翘的干燥果实，具有清热解毒、消肿散结、疏散风热功效［1］。药理学研究表明，连翘具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、解热镇痛等作用［2］。连翘苷是连翘的主要药理活性成分之一［3］。以连翘为原料药，目前已开发出许多成方制剂，包括中成药鼻用制剂，如复方连翘滴鼻液，其主要由连翘、板蓝根、芦根、郁金、地黄、知母、广藿香等药材提取制成，通过鼻黏膜吸收，用于防治病毒性感冒、病毒性肝炎、扁桃体炎等。本研究中探讨了其提取工艺及质量控制，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1200 型高效液相色谱仪（美国 Agilent 公司）、AB135-S 型电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司，精度为 0.01 mg）；PHS-3C 型精密 pH 计（上海康仪仪器有限公司）；AP-01P 型真空泵（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；GT-2013QTS 超声波清洗机（广东固特超声股份有限公司）。

1.2 试药

复方连翘滴鼻液（批号分别为20190406，20190410，20190411，20190412）及各阴性样品均由中国人民解放军西部战区总医院制剂中心提供；连翘苷对照品（批号PCS0588-180105，含量为98%），菝葜皂苷元对照品（批号PCS1009-170905，含量为98%），均购自成都植标化纯生物技术有限公司；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 样品提取

水提工艺筛选：采用 L9（34）正交试验法，以加水量（A）、煎煮时间（B）、煎煮次数（C）为考察因素，因素水平见表1。以连翘苷含量为考察指标，通过正交试验确定最佳的水提工艺条件。正交试验设计与结果见表2［4］，方差分析结果见表3。由表2 可知，3 个因素对提取工艺的影响强弱依次为C ＞A ＞B；方差分析结果表明，因素C对水提工艺结果有显著影响。试验结果表明，最佳的水提工艺为A3B2C3。结合实际情况，现拟订工艺为加10 倍水，煎煮3 次，每次 1 h［5］。经验证，该工艺重复性良好，连翘苷平均含量为0.392 mg／mL，说明水提工艺稳定可行。

表1 因素水平表Tab.1 Factors and their levels

表2 L9（34）正交试验设计与结果Tab.2 Design and results of the L9（34）orthogonal test

表3 方差分析结果Tab.3 Results of the variance analysis

醇沉工艺筛选：根据优选的最佳水提工艺，对水提液进行醇沉工艺考察。取上述水提液5 份，每份200 mL，分别加入乙醇，使乙醇体积分数依次达到40%，50%，60% ，70% ，80%，静置 24 h，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，测定。结果药液中连翘苷含量分别为0.342，0.346，0.356，0.334，0.326 mg／mL。可见，当乙醇体积分数为60%时，提取后药液中连翘苷含量最高，因此确定乙醇体积分数为60%。

样品制备：根据水提和醇沉工艺考察结果，确定复方连翘滴鼻液的制备工艺为：按处方成分量及比例称取药材，加10 倍水，分别煎煮 3 次，每次 1 h，合并 3 次煎煮后的滤液，浓缩至相对密度为1.15 ～1.25，加入乙醇，调乙醇体积分数至60%，静置24 h，滤过，回收乙醇，加水适量，用 50%NaOH 溶液调 pH 至 6 ～ 7，再加入5%羟苯乙酯醇溶液约3 mL，加水定容至1 000 mL，搅匀，分装，即得。

2.2 定性鉴别

连翘：取样品20mL，用乙酸乙酯提取2 次，每次20mL，合并乙酸乙酯提取液，水浴蒸干，残渣加甲醇1 mL 使溶解，作为供试品溶液。取连翘苷对照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg 的溶液，作为对照品溶液。取缺连翘的阴性样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。按2015 年版《中国药典（四部）》通则 0502“薄层色谱法”项下方法吸取上述3 种溶液各8 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷 - 甲醇（5 ∶1，V ／ V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加热至斑点显色清晰。结果供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰。详见图1 A。

知母：取样品20mL，用乙醚振摇提取2 次，每次20mL，合并水溶液，用水饱和正丁醇振摇提取2 次，每次20 mL，合并正丁醇液，蒸干，残渣加乙醇20 mL 使溶解，加盐酸2 mL，加热回流1 h，放冷，加水10 mL，用石油醚（60 ～ 90 ℃）振摇提取 2 次，每次 20 mL，合并石油醚液，蒸干，残渣加乙酸乙酯1 mL 使溶解，作为供试品溶液。另取菝葜皂苷元对照品，加乙酸乙酯制成每1 mL 含0.5 mg 的溶液，作为对照品溶液。取缺知母的阴性样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。吸取上述3 种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以甲苯 -丙酮（9 ∶1，V ／ V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。结果供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰。详见图1 B。

2.3 连翘苷含量测定

2.3.1 色谱条件

色谱柱：YMC-Triart C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈 - 水（23 ∶77，V ／ V）；流速：1.0 mL ／min；检测波长：277 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.3.2 溶液制备

取连翘苷对照品适量，精密称定，加70%甲醇制成质量浓度为0.183 0 mg／mL 的对照品溶液。精密量取样品30 mL，加乙酸乙酯振摇提取3 次，每次25 mL，合并乙酸乙酯，蒸干，残渣加70%甲醇溶解，置100 mL 容量瓶中，加70%甲醇定容，摇匀，即得供试品溶液。取缺连翘的阴性样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。

2.3.3 方法学考察［6-11］

系统适用性试验：精密吸取2.3.2 项下3 种溶液各10 μL，按 2.3.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置有吸收峰，阴性对照无干扰。理论板数按连翘苷峰计应不低于3000，分离度均大于1.5，基线分离良好。详见图2。

线性关系考察：取对照品溶液依次稀释，得质量浓度为0.183 0，0.146 4，0.109 8，0.073 2，0.036 6 mg ／mL 的系列对照品溶液，按2.3.1 项下色谱条件分别进样，记录峰面积，以连翘苷质量浓度（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程 Y ＝7 159.9X+56.341，r ＝0.9992（n ＝5）。结果，连翘苷进样质量浓度在 0.0366 ～0.183 0 mg／mL 范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取同一对照品溶液适量，按2.3.1 项下色谱条件连续进样6 次，记录连翘苷峰面积。结果的 RSD 为 1.05%（n ＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取样品（批号20190406），依法制备供试品溶液，室温下分别于 0，2，4，8，12，24 h 时进样，测定峰面积。结果的 RSD 为 2.07% （n ＝ 6），表明供试品溶液室温放置24 h 内稳定。

重复性试验：取同一批（批号20190406）样品，按2.3.2 项下方法制备供试品溶液 6 份，按 2.3.1 项下色谱条件连续进样测定。结果连翘苷平均含量为0.314mg／mL，RSD 为 1.53%（n ＝ 6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取连翘苷含量为0.314 mg／mL 的供试品溶液适量，分别加入不同质量浓度的连翘苷对照品溶液，按 2.3.2 项下方法制备供试品溶液，按 2.3.1项下色谱条件进样测定，计算回收率。结果见表4。

表4 加样回收试验结果（n ＝9）Tab.4 Results of recovery tests（n ＝ 9）

2.3.4 样品含量测定

取 3 批（批号分别为 20190410，20190411，20190412）样品适量，按2.3.2 项下方法制备供试品溶液，再按2.3.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算样品含量。结果3 批样品中连翘苷的含量分别为0.338，0.346，0.342 mg ／mL。

3 讨论

3.1 提取工艺优选

该制剂处方提取工艺主要采用水提醇沉法，以连翘苷的提取率为指标，采用正交试验法优化，筛选最佳提取条件，优选工艺提取的成品质量稳定，且质量标准可控。

3.2 质控药材选择

质量标准部分主要包括定性鉴别和含量测定。定性鉴别中，由于处方药味较少，以水作为提取溶剂，故其中几味药材的鉴别试验未发现特征性斑点或分离效果较差，最终只完成了连翘、知母的定性鉴别。含量测定以连翘苷为指标，预试验结果表明，以乙腈 - 水（23 ∶77，V ／ V）为流动相、检测波长为277 nm 时样品各成分分离效果较好，可有效分离连翘苷与其他成分。方法学考察结果表明，仪器精密度良好，供试品溶液室温放置24 h 内稳定，方法重复性良好。