低水量蛋白酶酶解大豆浓缩蛋白工艺研究

杨 宁，宣 丽，梁丽萍，陈雪娇，李春雨，李洪根，权志中*

（1.沈阳市康普利德生物科技有限公司，辽宁沈阳 110161；2.辽宁康普利德生物科技有限公司，辽宁省饲料预消化专业技术创新中心，辽宁铁岭 112600；3.沈阳市现代农业研发服务中心<沈阳市农业科学院>，辽宁沈阳 110025；4.辽宁省农业发展服务中心，辽宁沈阳 110003）

大豆浓缩蛋白（SPC）是以脱脂大豆粕为原料，消除低聚糖肠胀气因子、胰蛋白酶抑制因子和凝集素等抗营养因子后的一种蛋白原料，蛋白质含量不低于65%[1-2]，目前被广泛应用于食品和饲料等领域[3-4]。抗原蛋白是大豆蛋白中的主要抗营养因子，其抗营养作用表现在以下几个方面：降低饲料蛋白质的利用率；活化免疫系统而加大动物维持营养需要；增加内源蛋白质的分泌，导致粪氮增加；出现过敏反应，使动物肠道受损，出现腹泻，导致生产性能下降甚至死亡[3-5]。SPC作为大豆蛋白产品之一，也含有抗原蛋白，在动物饲料中大量使用会引起肠道过敏、腹泻等消化应激反应[6-7]，导致饲料消化率降低，因此在一定程度上限制了其在饲料领域的应用。

目前，降解抗原蛋白的方法主要有物理法、化学法和生物酶解法[8]。生物酶解法可以通过不同酶制剂进行选择性酶解，被认为是降低甚至完全消除大豆蛋白抗原性的有效方法[9]。侯瑶[10]的研究表明，采用中性蛋白酶和胰蛋白酶酶解SPC，当水解度为2%时，β-伴大豆球蛋白的3个亚基基本被水解，而大豆球蛋白的酸性、碱性亚基也出现水解的情况，但水解并不彻底。张娜等[11]研究表明，采用碱性蛋白酶对SPC进行一次酶解，当水解度为3%时，β-伴大豆球蛋白的α亚基和β亚基基本被酶解，α' 亚基未全部酶解；采用风味蛋白酶进行二次酶解后，α'亚基全部被酶解。酶解法是生产肽产品的主要方式，具有底物专一、产物明确、稳定高效的特点，因此，本研究采用酶解法对SPC进行处理。当前酶解SPC的研究多集中在食品加工领域，主要考察酶解产物的溶解性、乳化性、发泡性、凝胶性等性质的变化，且酶解体系含水量都在90%以上，存在产物浓缩干燥能耗高、水消耗量大、人工成本高等问题[12-17]。为了降低酶解的生产成本，提高SPC在饲料中的应用效果，改善饲料利用率，本试验考虑在较低水量条件下，在不同的料水比、酶添加量、pH值、酶解温度等工艺条件下，对SPC进行酶解，考察水解度和酸溶蛋白指标，研究降低水量对酶解效果的影响，以期在控制加水量的同时，实现提高小肽含量及降解抗原蛋白的目的。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

SPC来源于益海（泰州）粮油工业有限公司，粗蛋白含量为66.7%，酸溶蛋白含量为1.1%。蛋白酶A（活力1.0×105U/g）、蛋白酶B（活力1.0×105U/g），均来自辽宁省饲料预消化专业技术创新中心实验室。

硼砂、十二烷基硫酸钠、邻苯二甲醛、1,4-二巯基苏糖醇、三氯乙酸、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷、甘氨酸、β-巯基乙醇、溴酚蓝、过硫酸铵、冰乙酸、甲醇、考马斯亮蓝、硼酸、甲基红、溴甲酚绿、硫酸铜、硫酸钾、浓盐酸、浓硫酸、氢氧化钠等，均来自国药集团化学试剂有限公司；丝氨酸标准品，纯度99.4%，标准品号GBW（E）100051，中国计量科学研究院。

1.2 仪器与设备

UV-1700型紫外可见分光光度计，日本岛津公司；HJ-M6型水循环磁力搅拌水浴锅，金坛市城西春兰实验仪器厂；STARTER 3100型pH计、CP 214型电子天平，上海奥豪斯仪器有限公司；K9860型全自动凯氏定氮仪，济南海能仪器股份有限公司；SC-3614型低速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；EPS-600型电泳仪，上海天能科技有限公司；101FA-0型电热鼓风干燥箱，上海树立仪器仪表有限公司。

1.3 试验方法

为了研究低水量的酶解效果，试验将酶解的料水比固定为1∶1.5（g∶mL），体系含水量为60%。酶解时间模拟动物消化过程，确定为6 h。酶解结束后灭酶，样品直接干燥、粉碎，然后进行指标测定。前期笔者对不同来源的多种蛋白酶进行了筛选，发现蛋白酶A和蛋白酶B在低水量条件下对SPC有较明显的酶解效果，本文首先通过单因素试验，分别确定蛋白酶A、蛋白酶B的最适添加量、pH及反应温度。在此基础上，选择蛋白酶A、蛋白酶B的最适酶解条件，研究不同料水比（1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2）对SPC水解度、酸溶蛋白含量及抗原蛋白降解效果的影响。

1.4 单因素试验

1.4.1 蛋白酶酶解条件优化单因素试验

（1）酶添加量对SPC水解度和酸溶蛋白含量的影响

称取20.00 g SPC于250 mL烧杯中，加入30 mL水，蛋白酶A添加量分别为0.1%、0.3%、0.6%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%，调整溶液pH值至9.5，55 ℃酶解6 h；蛋白酶B添加量分别为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.8%、1.0%，不调整溶液pH值，55 ℃酶解6 h。反应结束后，沸水浴灭酶，样品80 ℃烘干，粉碎后测定SPC的水解度和酸溶蛋白含量。

（2）pH对SPC水解度和酸溶蛋白含量的影响

称取20.00 g SPC于250 mL烧杯中，加入30 mL水，蛋白酶A添加量为3.0%，分别调整溶液pH值为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5，55 ℃酶解6 h；蛋白酶B添加量为0.8%，分别调整溶液pH值为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，55 ℃酶解6 h。反应结束后，沸水浴灭酶，样品80 ℃烘干，粉碎后测定SPC的水解度和酸溶蛋白含量。

（3）温度对SPC水解度和酸溶蛋白含量的影响

称取20.00 g SPC于250 mL烧杯中，加入30 mL水，蛋白酶A添加量为3.0%，调整溶液pH值为9.0；蛋白酶B添加量为0.8%，调整溶液pH值为6.5，酶解温度分别为40、45、50、55、60 ℃，酶解6 h。反应结束后，沸水浴灭酶，样品80 ℃烘干，粉碎后测定水解度和酸溶蛋白含量。

1.4.2 不同料水比对两种蛋白酶酶解效果的影响

本试验设置了低水量条件下（料水比分别为1∶0.5、1∶1.0、1∶1.5、1∶2.0），采用蛋白酶A和蛋白酶B的最适添加量、pH、温度对SPC进行酶解处理，观察不同水分含量时SPC的酶解情况。观察水解度、酸溶蛋白含量、抗原蛋白降解效果等指标。

1.5 测定指标与方法

1.5.1 水解度

采用邻苯二甲醛（OPA）法[18]测定样品的水解度。

1.5.2 酸溶蛋白含量

参照GB/T22492—2008附录B[19]测定酸溶蛋白含量。

1.5.3 抗原蛋白降解效果评价

根据Laemmli[20]的方法进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）试验。

1.6 数据分析

采用SPSS 22.0统计软件对数据进行处理，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05表示两者之间存在显著差异。试验结果以“平均值±标准差”形式表示。

2 结果与分析

2.1 蛋白酶最适添加量的确定

随着蛋白酶A、蛋白酶B添加量的变化，SPC水解度及酸溶蛋白含量的变化趋势如图1、2所示。

图1 蛋白酶A添加量对SPC水解度和酸溶蛋白含量的影响Fig.1 Effect of protease A enzyme amount on degree of hydrolysis and acid soluble protein content of SPC

由图1可知，随着蛋白酶A添加量的增加，SPC的水解度和酸溶蛋白含量变化趋势一致，均呈持续上升趋势。当添加量从0.1%增加到3.0%时，水解度及酸溶蛋白含量显著升高（P＜0.05），添加量继续增加到4.0%时，水解度和酸溶蛋白含量略有升高，但差异不显著（P＞0.05），表明蛋白酶A的最适添加量为3.0%。

图2 蛋白酶B添加量对SPC水解度和酸溶蛋白含量的影响Fig.2 Effect of protease B enzyme amount on degree of hydrolysis and acid soluble protein content of SPC

由图2可知，随着蛋白酶B添加量的增加，SPC的水解度和酸溶蛋白含量均呈先增加后基本不变的趋势。当添加量从0.1%增加到0.8%时，水解度及酸溶蛋白含量显著升高（P＜0.05），酶添加量继续增加到1.0%时，水解度和酸溶蛋白含量略有升高，但差异不显著（P＞0.05），表明蛋白酶B的最适添加量为0.8%。

2.2 蛋白酶最适pH的确定

蛋白酶A、蛋白酶B作用时，随着pH的变化，SPC水解度及酸溶蛋白含量的变化趋势分别见图3、4。

图3 蛋白酶A酶解pH对SPC水解度和酸溶蛋白含量的影响Fig.3 Effect of protease A pH on degree of hydrolysis and acid soluble protein content of SPC

由图3可知，蛋白酶A在碱性环境中酶解效果更好。随着酶解pH的升高，SPC水解度和酸溶蛋白含量均呈持续上升趋势。当pH为6.5和7.0时，水解度和酸溶蛋白含量的差异不显著（P＞0.05），当pH从7.5升高到9.0时，水解度和酸溶蛋白含量显著上升（P＜0.05），当pH继续增加到9.5时，水解度和酸溶蛋白含量略有上升，但差异不显著（P＞0.05），表明蛋白酶A的最适pH为9.0。

图4 蛋白酶B酶解pH对SPC水解度和酸溶蛋白含量的影响Fig.4 Effect of protease B pH on degree of hydrolysis and acid soluble protein content of SPC

由图4可知，随着酶解pH从5.0升高到8.0，SPC水解度和酸溶蛋白含量均呈现先升高后降低的变化趋势，说明蛋白酶B在中性偏酸环境中酶解效果更好。当pH为6.5时，水解度和酸溶蛋白含量均达到最大值，分别为14.1%和31.1%，表明蛋白酶B的最适pH为6.5。

2.3 蛋白酶最适反应温度的确定

蛋白酶A、蛋白酶B作用时，随着酶解温度的变化，SPC水解度的变化趋势见图5。

图5 蛋白酶酶解温度对SPC水解度的影响Fig.5 Effect of protease enzymolysis temperature on degree of hydrolysis and acid soluble protein content of SPC

由图5可知，当酶解温度为40 ℃时，蛋白酶A的酶解效果略优于蛋白酶B，随着温度继续上升，蛋白酶B的酶解效果均优于蛋白酶A。随着温度的升高，两种蛋白酶作用后，SPC水解度均呈现先增后减的趋势，当温度从40 ℃升高到50 ℃时，显著升高（P＜0.05），当温度从50 ℃继续升高到60 ℃时，两种蛋白酶作用后，SPC水解度均显著下降（P＜0.05），表明两种蛋白酶的最适反应温度均为50 ℃。

2.4 不同料水比条件下两种蛋白酶的酶解效果

在单因素试验基础上，改变酶解料水比，考察降低水分含量对SPC水解度、酸溶蛋白含量、抗原蛋白含量的影响。水解度及酸溶蛋白含量测定结果见表1，电泳结果见图6。

由表1可知，随着酶解体系水量的增加，不论是蛋白酶A还是蛋白酶B作用，SPC水解度和酸溶蛋白含量均显著升高（P＜0.05），但增幅逐渐变缓。

由图6可知，豆粕中的抗原蛋白含量较高，β-伴大豆球蛋白的3个亚基和大豆球蛋白的酸性、碱性亚基条带明显。大豆浓缩蛋白有效地去除了豆粕中的部分抗营养因子[21]，抗原蛋白条带已经明显减弱。经两种蛋白酶酶解后的SPC，β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白的条带均完全消失，可见，即使在低水量条件下，这两种蛋白酶亦对β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白具有很好的降解能力。

表1 不同料水比对SPC水解度和酸溶蛋白含量的影响Table 1 Effect of ratio of material to water on degree of hydrolysis and acid soluble protein content of SPC

结合表1数据可知，当SPC的水解度高于3.7%，酸溶蛋白含量高于6.6%时，抗原蛋白条带完全消失。相同料水比条件下，蛋白酶B的水解度值均高于蛋白酶A，表明蛋白酶B酶解能够释放更多的游离氨基。当酶解体系含水量小于50%时，蛋白酶A酶解能够提供更高的酸溶蛋白含量；当酶解体系含水量大于50%小于70%时，蛋白酶B能够提供更高的酸溶蛋白含量。

本试验中选取的两种蛋白酶在低水量条件下酶解SPC时，最适添加量和pH有较大差异，实际生产中可根据物料体系水分含量、酸碱度、营养指标等多种需求，选择合适的蛋白酶。

图6 低水量条件下蛋白酶酶解SPC后电泳结果Fig.6 Electrophoresis results of SPC hydrolyzed by protease under low water content

3 讨论

前人研究发现，生物酶解法的酶解效果受酶的种类、酶解条件等多种因素影响。如张梅等[14]采用Alcalase蛋白酶对SPC进行酶法改性研究，结果发现，当底物质量浓度5%（料水比为1∶20），酶浓度2%（E/S），pH8.5，62 ℃酶解4 h，水解度大于12%；郑芳燕等[15]研究表明，采用Alcalase碱性蛋白酶对SPC进行酶法处理，当底物质量浓度10%（料水比为1∶10），酶浓度0.5%（占底物），pH8.0，50 ℃酶解3 h时，水解度为6.37%；马宇翔等[16]研究表明，采用菠萝蛋白酶对SPC进行酶法改性，酶解的最佳条件为pH6.5，反应温度48 ℃，底物质量浓度6%（料水比为1∶16.7），加酶量607 U/g，此条件下水解4 h，水解度可达11.07%。以上研究结果表明，酶的种类不同，酶解效果不同；同一种酶，酶解条件不同，酶解效果也不同。本试验中选取的两种蛋白酶也得到了相似的结论。另外，以上研究中，酶解体系含水量均≥90%。本试验中，蛋白酶A在料水比1∶2，酶添加量3%，pH 9.0，50 ℃酶解6 h，水解度可达到12.4%；蛋白酶B在料水比1∶1.5，酶添加量0.8%，pH 6.5，50 ℃酶解6 h，水解度可达到14.2%。可见，本试验在降低加水量的同时依然保证了较高的水解度。且本试验中所用的两种蛋白酶，当水解度高于3.7%时，即可将SPC中的抗原蛋白完全降解。可见，通过优化蛋白酶对SPC的酶解条件，即使在低水量条件下，也可实现降解抗原蛋白的目的。

4 结论

本试验在较低水分条件下，以水解度和酸溶蛋白含量为考察指标，确定了两种蛋白酶在料水比为1∶1.5，酶解时间为6 h时SPC酶解的最适添加量、pH和温度。其中蛋白酶A最适作用条件为蛋白酶添加量3%，pH 9.0、温度50 ℃；蛋白酶B最适作用条件为蛋白酶添加量0.8%，pH6.5、温度50 ℃。当料水比为1∶0.5时，蛋白酶A酶解SPC，水解度为3.7%，酸溶蛋白含量为7.4%；蛋白酶B酶解SPC，水解度为4.0%，酸溶蛋白含量为6.7%；SDS-PAGE电泳结果表明，此时SPC中抗原蛋白条带可实现明显降解。