通痹方药效部位提取工艺优化及抗炎镇痛作用研究

赵 雨，王 倩，兰亚荣，张立明，2，3*

(1.宁夏医科大学 药学院，宁夏 银川 750004；2.宁夏特色中医药现代化工程技术研究中心，宁夏 银川750004；3.回医药现代化省部共建教育部重点实验室，宁夏 银川 750004)

骨痹是五体痹中的一种，是因风寒湿邪久羁人体筋骨关节、闭阻经脉气血所致的肢体痹证类疾病[1-2]，相当于现代医学中的风湿性关节炎、腰椎间盘突出症、强直性脊柱炎、肩周炎等骨伤科痹证。中医认为“气血痹阻不通，筋脉关节失于濡养”是骨痹的主要病机，然而西医对其病因仍不十分明确。目前西医仍缺乏针对该病病因有效的治疗措施，且治疗时间长、费用高昂、易复发。而中药制剂有其独特的优势，表现出整体调节、多层次、多靶点的特点，在缓解症状、提高患者生活质量方面疗效显著，且副作用小，为多数患者接受。

通痹方是宁夏回族自治区中医医院临床应用多年的中药复方，专治骨伤科痹证，由没药、白胡椒、红花、川乌、伸筋草、桑枝6味中药组成[3]，其中川乌、伸筋草温经散寒，白胡椒温中止痛、散寒除湿，桑枝祛风湿、通经络，没药散瘀定痛，红花活血通经、散肿止痛，具有显著的活血消肿、抗炎通络、祛风散寒、除湿止痛等作用[4-5]。该通痹方已在宁夏中医医院临床应用多年，效果良好，无毒副作用，需要进一步研究其药效成分及药理作用为新药开发奠定基础。因此本文主要就通痹方的提取工艺优化和抗炎镇痛作用进行研究。

1 材料与仪器

1.1 实验动物

雌性KM小鼠，体质量18～22g，购自宁夏医科大学实验动物中心。动物饲养于由宁夏医科大学实验动物中心无特定病原体(Specific pathogen free，SPF)级动物房。实验环境：温度：(22±2)℃，相对湿度：50%～60%，动物房保持通风、干燥，自由饮水，鼠料定量饲养。

1.2 药材与药品

红花(安徽泰源中药饮片有限公司，批号：141016)；没药(石家庄市柏林药材加工厂，批号：070101)；白胡椒(石家庄市柏林药材加工厂，批号：070101)；川乌(石家庄市柏林药材加工厂，批号：170101)；桑枝(石家庄市柏林药材加工厂，批号：070101)；伸筋草(石家庄市柏林药材加工厂，批号：070101)；野木瓜片(广东和平药业有限公司，批号：Z44021242)；双氯芬酸钠缓释片(诺华制药，批号：H10980297)；复方对乙酰氨基酚片(西南药业股份有限公司，批号：H20013003)。

1.3 实验试剂

无水乙醇(天津市大茂化学试剂厂)；吐温-80(100 mL，天津市大茂化学试剂厂)；羧甲基纤维素钠(CMC-Na)(500 g，天津市大茂化学试剂厂)；生理盐水(4.5 g，湖南科伦制药有限公司)。

1.4 实验仪器

XL-08B粉碎机(广东市旭朗机械设备有限公司)；RE-2000A型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；DHG-9075A型电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；BWSsn电子计重称(厦门佰伦斯电子科技有限公司)；XB 220A电子分析天平等。

2 实验方法

2.1 工艺路线

根据通痹方中各味药的特点，确定提取工艺为先进行挥发油部位提取，再进行醇溶性部位提取。

2.2 挥发油部位提取工艺优化[6-7]

2.2.1 供试品溶液制备 取粉碎后的药材1份，置于1 000 mL圆底烧瓶中，加入沸石2～3粒，加入蒸馏水，浸泡一定时间后，置于电热套上，连接挥发油提取器及球形冷凝管，开启加热，开启冷凝水，温度保持微沸，直至提取结束，挥发油不再增加(照中国药典2015年版四部《通则2204挥发油测定法》甲法项下方法进行提取)，读取挥发油提取器中油状液体(挥发油部位)体积并收集于西林瓶中，得到挥发油部位。

2.2.2 挥发油提取正交试验 选取浸泡时间(h)、加水倍数(倍)、提取时间(h)三个因素，每个因素设定3个水平，采用L9(33)设计正交试验考察水蒸气蒸馏法对挥发油提取的影响，以挥发油量为指标，正交试验设计见表1。

表1 挥发油部位提取正交试验因素水平

2.3 醇溶性部位提取工艺优化[8]

2.3.1 供试品溶液制备 将提取挥发油后的药液过滤，药渣置于圆底烧瓶中，加入乙醇，连续回流，滤过，用乙醇清洗药渣和容器，滤液旋至稠浸膏状，用乙醇转移至蒸发皿中，自然挥干乙醇后，置于烘箱烘干，即得醇溶性部位。

2.3.2 醇提正交实验 选取乙醇浓度(%)、乙醇用量(mL/g)、提取时间(h)三个影响因素，每个因素设计3个水平，用L9(33)正交表实验优选乙醇回流提取工艺，以方中胡椒碱含量(色谱峰峰面积)为指标，正交试验设计见表2。

表2 醇部位提取正交试验因素水平

2.4 高效液相法(HPLC)测定醇溶性部位有效成分(胡椒碱)含量

2.4.1 色谱条件 C18柱；流动相：甲醇-水(77∶ 23)；检测波长：343 nm；流速：1 mL/min；进样10 μL；柱温：25 ℃。

2.4.2 对照品溶液制备 精密称取胡椒碱对照品0.005 g，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，作对照品溶液，备用。

2.4.3 供试品溶液制备 分别精密称取各组醇部位浸膏约0.1 g，置于已编号(①～⑨)的10 mL容量瓶中，加甲醇溶解(必要时可超声加速溶解)，并定容至刻度，做供试品溶液备用。0.45 μm微孔滤膜过滤，分别置于已标号(①～⑩)的进样瓶中，照色谱条件自动进样，记录峰面积及保留时间(表7)。

2.4.4 方法学考察 (1)线性关系。精密吸取不同浓度的对照品溶液，分别进样，记录色谱图，绘制工作曲线见图1。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，线性回归，得回归方程。

(2)精密度。分别精密吸取③号醇部位供试品溶液，按上述色谱条件连续重复进样6次，测定峰面积，结果见表9。

(3)稳定性。精密吸取③号醇部位供试品溶液，分别于放置0、3、6、9、12、24 h后进样，记录色谱图，峰面积见表10。

(4)重复性。取③号醇部位供试品，按供试品溶液制备方法，平行制备6份溶液，依法进样，峰面积见表11。

2.5 抗炎镇痛作用研究[9-12]

2.5.1 热板法致小鼠疼痛实验 将60只SPF级小鼠随机分为6组，每组10只，分别为：①空白对照组(1 mL1%吐温-80+生理盐水)；②挥发油组(3 mL/kg，由1%吐温-80+生理盐水制成溶液)；③醇部位组(以通痹方生药量计，下同)(3 g/kg，由0.5% CMC-Na制成混悬液)；④挥发油+醇部位组(1.5 mL/kg+1.5 g/kg，由0.5%CMC-Na制成混悬液)；⑤阳性对照组1(对乙酰氨基酚，0.3 g/kg，由0.5%CMC-Na制成混悬液)；⑥阳性对照组2(野木瓜片1.2 g/kg，由0.5%CMC-Na制成混悬液)。

将热板箱放入装满水的恒温水浴锅中，使水温控制在(55±0.5)℃ (用温度计测量)。热板箱预热 10 min后，将70只雌性小鼠逐只放入热板箱中，用秒表记录小鼠自放入热板箱后至出现舔后足的时间(s)作为每只小鼠的痛阈值。每日定时给各组小鼠进行灌胃给药1次，根据小鼠体重确定给药量，连续7 d，空白组除外，末次给药后30 min、1 h各测1次痛阈，凡在热板上60 s内无反应的小鼠立刻取出，痛阈值以60 s计(以免烫伤小鼠足趾)。

2.5.2 二甲苯致小鼠耳肿胀实验 将60只SPF级小鼠随机分为6组，每组10只，分别为：①空白对照组(1%吐温-80+生理盐水)；②挥发油组(3 mL/kg，由1%吐温-80+生理盐水制成溶液)；③醇部位组(3 g/kg，由0.5%CMC-Na制成混悬液)；④挥发油+醇部位组(1.5 mL/kg+1.5 g/kg，由0.5%CMC-Na制成混悬液)；⑤对照1(双氯芬酸钠，0.04 g/kg，由0.5%CMC-Na制成混悬液)；⑥对照2(野木瓜片1.2 g/kg，由0.5% CMC-Na制成混悬液)，除空白组外，每日定时给各组小鼠进行灌胃给药1次，根据小鼠体重确定给药量，连续7 d，末次给药30 min后，各组小鼠右耳廓前后均匀涂抹二甲苯0.02 mL/只致炎，左耳作对照。

半小时后脱颈椎处死，沿耳廓基线剪下双耳，并采用直径为7 mm的不锈钢打孔器将小鼠双耳同部位等面积切下，分析天平称重，计算两耳重量之差，小鼠左右两侧耳片重量差即为肿胀度，计算各组小鼠耳肿胀抑制率(%)。耳肿胀抑制率(%)=(空白组组平均肿胀度-给药组平均肿胀度) /空白组平均肿胀度×100%。

2.6 统计学处理

3 结果

3.1 挥发油部位提取工艺优化

表3 挥发油部位提取正交试验结果

表4 结果分析

根据表1挥发油因素水平表进行实验，读取挥发油毫升数，最终得出结果见表3：在实验条件下挥发油最优提取工艺为A3B1C3(加水10倍，浸泡1 h，提取10 h)。各因素对挥发油提取率的影响顺序为C>B>A，即提取时间>加水倍数>浸泡时间。见表4。

3.2 醇部位提取工艺优化

表5 醇部位提取正交试验结果

根据表2醇部位因素水平表实验，通过高效液相色谱法确定醇部位指标性成分含量(见表5)，最终得出结果见表6、表7。在该实验条件下，醇部位最优提取工艺为A3B1C3(乙醇浓度85%，乙醇用量6倍，提取时间3 h)。各考察因素对醇部位提取率的影响顺序为A>B>C，即乙醇浓度>乙醇用量>提取时间。

3.3 HPLC测定醇溶性部位有效成分(胡椒碱)含量实验结果

在优化实验条件下对标准液进行稀释，以胡椒碱标准品的浓度为横坐标、色谱峰面积为纵坐标作图，得线性回归方程及相关系数，见图1。结果表明，胡椒碱在0.000 5～0.012 5 mg/μL范围内均具有良好的线性关系，相关系数为0.984 9。

在优化实验条件下对样品进行测定，精密度实验中色谱峰保留时间RSD为0.14%，峰面积RSD为0.19%，表明该方法的精密度良好；稳定性实验中色谱峰保留时间RSD为1.08%，峰面积RSD为0.24%，说明稳定性良好，样品至少在24 h内稳定；重复性实验中色谱峰保留时间RSD为1.31%，峰面积RSD为0.26%，说明该方法重复性良好。详见表8、表9、表10。

表6 结果分析

表7 HPLC法测定醇部位指标性成分含量结果

图1 线性关系考察

表8 精密度考察

表9 稳定性实验考察

表10 重复性测定

3.4 抗炎镇痛作用研究

3.4.1 热板法致小鼠疼痛实验结果 实验结果显示，与空白对照组相比，通痹方挥发油组、醇部位组、挥发油+醇部位组在给药0 min、15 min和30 min后均对热刺激小鼠所致疼痛反应潜伏期(痛阈值)升高，其中醇部位组、挥发油+醇部位的小鼠在给药15、30 min后热刺激所致疼痛反应潜伏期(痛阈值)较其他给药组显著升高(P<0.05)。实验结果表明通痹方中挥发油、醇部位、挥发油+醇部位对热板所致的小鼠疼痛均有抑制作用，但挥发油+醇部位抑制疼痛作用较其他部位更显著，且在给药30 min后抑制疼痛效果显著(P<0.05)。结果见表11。

表11 通痹方对热板致小鼠疼痛反应的影响

3.4.2 二甲苯致小鼠耳肿胀实验结果 实验结果显示，与空白对照组相比，各给药组在给药30 min后对二甲苯引起的小鼠的耳肿胀均有抑制作用。其中，通痹方醇部位较其他给药组对二甲苯引起的小鼠的耳肿胀有显著抑制作用，差异具有统计学意义(P<0.05)，肿胀抑制率达到了33.4%。表明通痹方中各部位具有一定的抗炎作用，醇部位较其他部位抗炎作用强。结果见表12。

表12 通痹方对二甲苯致小鼠急性耳肿胀抑制率的影响

4 讨论

在中医理论中，痹证、顽痹、痛风等是由于正气不足、气血运行不畅而引起的表现为关节肿胀、疼痛、屈伸不利等症状的一类疾病。该病在临床上以膝关节疼痛反复发作、关节变形及不同程度的功能障碍为特点[13-14]，可伴有体重减轻、低热、疲乏感、晨僵、疼痛、畸形、类风湿结节等全身症状。

通痹方是由没药、白胡椒、红花、川乌、伸筋草、桑枝组成的经验方，方中药物含有丰富的挥发油、生物碱与黄酮类成分。没药挥发油、白胡椒挥发油、红花黄色素、桑皮苷、乌头碱等能明显抑制二甲苯所致小鼠耳廓肿胀及大鼠蛋清所致的足趾肿胀，提高小鼠痛阈值。该方剂理论和临床应用基础良好。

本研究结果显示，通痹方挥发油部位的最优提取工艺为：加水10倍，浸泡1 h，提取10 h。醇部位的最优提取工艺为：乙醇浓度85%，乙醇用量6倍，提取时间3 h。在抗炎镇痛实验中，与空白对照组相比，末次给药0、15、30 min后，通痹方醇部位和挥发油+醇部位组的小鼠热刺激所致疼痛反应潜伏期(痛阈值)显著提高(P<0.05)，其镇痛作用明显。在抗炎实验中，只有醇部位组，小鼠耳肿胀抑制率达到了33.4%，与空白组比较差异具有统计学意义(P<0.05)，而挥发油组、挥发油+醇部位组小鼠耳肿胀抑制率与空白组比较差异无统计学意义。

综上所述，经过提取工艺优化过的通痹方具有明显的抗热刺激痛作用，并具有一定的抗炎效果，但其抗炎镇痛的作用机制和相关通路还有待进一步研究。