KLF5通过激活Wnt通路对HpSlyD诱导胃黏膜肠化生作用的影响

季永欣，王春子，李雪，李 莉

季永欣，王春子，李雪，浙江中医药大学附属湖州中医院急诊科 浙江省湖州市 313000

李莉，浙江中医药大学附属湖州中医院消化科 浙江省湖州市 313000

0 引言

胃癌是起源于胃黏膜上皮的常见消化道恶性肿瘤之一，在我国各种恶性肿瘤中发病率居首位，好发于50岁以上人群，且近年来呈年轻化趋势.目前胃癌的诊断和治疗方面存在诸多问题，由于早期胃癌多数患者无明显症状，难以引起足够重视，且胃镜检查早期胃癌检出率低，因此大多数患者就诊时都处于中晚期，对放化疗治疗敏感性较差，5年生存率明显低于早期胃癌患者[1].胃癌的发生发展是一个渐进过程，胃黏膜肠化生(gastric intestinal metaplasia，GIM)在此过程中是胃黏膜从良性向恶性转变的重要环节，是胃黏膜在修复过程中偏离正常轨道的表现[2].已有研究证实GIM为肠型胃癌密切相关的癌前病变[3]，因此探讨GIM发生、持续、发展过程，对于逆转癌前病变、选择合适的干预治疗靶点具有重要意义.Krüppel样因子5(krüppel-like factor 5，KLF5)是一种可与DNA结合的锌指转录调节因子，广泛参与胚胎发育、细胞增殖、分化、凋亡等多种生物学过程[4].目前已发现KLF5在诸多肿瘤组织中表达异常，并通过调控下游众多靶蛋白及相关信号通路，在肿瘤发生发展过程中扮演者重要角色[5].Wnt信号通路在肿瘤的发生发展过程中起着重要的调节作用.Wnt通路激活后细胞周期和凋亡相关基因、生长因子和粘附分子开始转录，参与肿瘤的发生发展.研究表明，在KLF5基因敲除小鼠中，Wnt通路被抑制，肠上皮内稳态被破坏[6].既往研究发现一个新的、与胃癌变相关幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H.pylori)毒力因子-肽酰-脯氨酰顺反式异构酶，编码蛋白为H.pyloriSlyD(HpSlyD)具有促进细胞增殖，抑制凋亡的能力.本研究通过HpSlyD诱导GIM的发生，旨在探究KLF5对GIM发生机制的影响.

1 材料和方法

1.1 材料 正常胃粘膜和肠上皮化生组织的选取:收集2015-05/2018-01在我院病理科存档的石蜡标本，包括正常胃黏膜标本20例来自良性胃病患者，均无癌症相关性疾病病史; 病理诊断证实为肠化生的胃黏膜标本20例，所有患者均签署知情同意书.

HpSlyDH.pylori重组蛋白(中国医科大学附属肿瘤研究所肿瘤病因与筛查研究室制备); 胰蛋白酶(上海康朗生物科技有限公司); RNA提取试剂盒(哈尔滨新海基因检测有限公司); RIPA(上海吉至生化科技有限公司);蛋白酶抑制剂(上海伟寰生物科技有限公司); MTT试剂盒(上海恒斐生物科技有限公司); Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒(广州威佳科技有限公司); SDS-PAGE蛋白缓冲液(北京百奥莱博科技有限公司); ECL显影液(上海士锋生物科技有限公司); 相关抗体(英国Abcam公司).

超净工作台(上海辅泽商贸有限公司); 紫外分光光度计(上海科敏生物科技有限公司); 恒温水浴锅(南京贝登医疗股份有限公司); 倒置显微镜(北京佳源兴业科技有限公司); 酶标仪(北京安麦格贸易有限公司); 低速离心机(上海翊圣生物科技有限公司); 电泳槽(广州威佳科技有限公司); 转膜仪(上海艾研生物科技有限公司); 水平摇床(武汉纯度生物科技有限公司); 化学发光成像系统(上海易孛特光电技术有限公司).

1.2 方法 将细胞分为空白对照组、HpSlyD组(200 ng/mL的HpSlyD处理)、干扰对照组(200 ng/mL的HpSlyD+阴性序列)、干扰KLF5组(200 ng/mL的HpSlyD +KLF5 siRNA)、Wnt激动剂组(200 ng/mL的HpSlyD +KLF5 siRNA+氯化锂)、Wnt激动剂+干扰KLF5组.GES1细胞常规培养于含10%胎牛血清、青霉素、链霉素各100 μ/mL的RPMI-1640培养液中，置于37 ℃、5%CO2培养箱中进行培养，根据细胞生长情况2-3 d更换培养液，细胞长至50%-60%密度时，将50 nmol/L浓度KLF5 siRNA和阴性序列转染GES1细胞，24 h更换培养液，加入200 ng/mL的HpSlyD处理，置于37 ℃、5%CO2培养箱中进行培养24 h，观察细胞感染情况.

1.3 检测方法

1.3.1 RT-PCR法检测相关基因表达:取出GES1细胞(正常胃黏膜组织、肠化生组织)，加入Trizol试剂提取总RNA，取5 μL提取的总RNA，采用分光光度仪测定样品光密度值，计算RNA纯度和浓度.按照试剂说明配制反应体系和设定反应时间进行逆转录反应，按照引物说明书进行参数设置，冰上进行PCR反应体系的制备，设阴性对照组.采用2-△△CT公式分析KLF5、Wnt3a、绒毛蛋白1(Villin 1，VIL1)、三叶因子Ⅱ(trefoil factor 2，TFF2)、尾侧同源盒因子2(caudal homeobox factor 2CDX2)表达量.

1.3.2 MTT法检测各组GES1细胞增殖情况:取对数生长期的GES1细胞，接种于24孔板中，在每个孔中加入浓度为5 mg/mL MTT溶液20 μL和l80 μL的改良性RPMI-1640培养基，培养4 h后，丢弃上清液并添加150 μL DMSO，上清液在恒温震荡箱中摇10 min，用酶标法测定各组492 m波长处的吸光度值.细胞增殖抑制率=(1-实验组OD值/对照组OD值).

1.3.3 流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况:GES1细胞接种于6孔板，次日转染和换液，48 h后进行消化细胞并用新鲜培养基重悬，PBS洗涤两次收集细胞1-5×105/mL，加Binding Buffer 500 μL，分别加入Annexin V-FITC和PI各50 μL混匀，60 min内进行流式细胞仪观察和检测.

表1 肠化生组织中KLF5、Wnt3a蛋白表达分析(mean±SD)

表2 干扰KLF5表达对HpSlyD诱导的GES1细胞增殖、凋亡的影响(mean±SD)

表3 干扰KLF5表达对HpSlyD诱导的GES1细胞肠化生蛋白的影响(mean±SD)

1.3.4 Western blot法检测蛋白的表达:收集各组GES1细胞，按照BCA法测定蛋白浓度，蛋白液中滴加5×SDS上样缓冲液，充分离心使蛋白质变性，-80 ℃保存; 制备浓缩胶和分离胶，采用恒定电压进行电泳，1 h后电转移至PVDF膜，常温封闭2 h.将一抗用TBST稀释至适当浓度加入，4 ℃孵育过夜，加入相应的二抗室温孵育2 h，电化学发光试剂显色、曝光.

统计学处理本研究数据均采用SPSS 21.0软件包进行分析，计量数据均采用(mean±SD)表示，多个样本数据间的比较先进行方差齐性检验，方差相等时采用t检验或方差分析，P＜0.05视为具有统计学意义.

2 结果

2.1 肠化生组织中KLF5、Wnt3a mRNA和蛋白表达分析 RT-PCR法、Western blot法检测结果显示，KLF5、Wnt3a mRNA和蛋白表达量在肠化生组织中明显高于在正常胃黏膜中的表达，差异具有统计学意义(P＜0.01).见表1、图1.

2.2 干扰KLF5表达对HpSlyD诱导的GES1细胞增殖、凋亡的影响 HpSlyD组、干扰对照组细胞增殖率明显高于空白对照组、凋亡率明显低于空白对照组(P＜0.05)，干扰KLF5组细胞增殖率明显低于HpSlyD组、凋亡率明显高于HpSlyD组(P＜0.05).见表2、图2、图3.

2.3 干扰KLF5表达对HpSlyD诱导的GES1细胞肠化生蛋白的影响 HpSlyD组、干扰对照组细胞VIL1、TFF2、CDX2 mRNA和蛋白表达明显高于空白对照组(P＜0.05)，干扰KLF5组细胞VIL1、TFF2、CDX2 mRNA和蛋白表达明显低于HpSlyD组(P＜0.05).见表3、图4.

表4 Wnt激动剂对干扰KLF5表达调节细胞中相关基因的影响(mean±SD)

图1 Western blot法检测KLF5、Wnt3a蛋白表达.组 KLF5:Krüppel样因子5.

图2 干扰KLF5表达对HpSlyD诱导的GES1细胞增殖、凋亡的影响.HpSlyD组 vs 空白对照组、干扰对照组 vs 空白对照组aP＜0.05; 干扰KLF5组 vs HpSlyD组比较bP＜0.05.

2.4 Wnt激动剂对干扰KLF5表达调节细胞中相关基因的影响 HpSlyD组、干扰对照组细胞Wnt3a、β-catenin、CDX2 mRNA表达明显高于空白对照组(P＜0.05)，干扰KLF5组细胞Wnt3a、β-catenin、CDX2 mRNA表达明显低于HpSlyD组(P＜0.05).而Wnt激动剂+干扰KLF5组Wnt3a、β-catenin、CDX2 mRNA表达明显高于干扰KLF5组(P＜0.05).见表4.

3 讨论

我国胃癌发病率高居常见恶性肿瘤第二位，已成为严重的社会公共卫生问题.肠化生和异型增生是重要的胃黏膜癌前病变，往往首先导致胃中央凹的形态学改变，表现为病灶黏膜的不同程度萎缩、糜烂，肠化的发生可提高胃癌发生风险10倍以上[7]，因此探讨GIM的病变机制，继续寻找胃癌可能的早期诊断和可能的治疗靶点是非常重要的.

KLF5属于KLF家族，人源性KLF5基因位于第13号染色体长臂21区1带，由4个外显子、3个内含子组成.KLF5基因编码的蛋白是一种核转录激活剂，细胞质翻译完成后，其可通过核孔进入细胞核结合靶基因启动子5'端上游的特定序列，对相关基因的表达起调节作用.KLF5在肿瘤发生和发展过程中涉及到多种病理过程和基因的修饰[8].相关资料显示，KLF5参与多种信号通路影响加速通过G1/S期和G2/M期来促进细胞增殖，然而也有一部分学者认为KLF5在雌激素受体阳性的乳腺癌细胞中起抑制增殖的作用，因为其可能降低雌激素受体对促增殖基因的激活，最终消除后者促进细胞增殖的作用[9].此外KLF5还可通过影响细胞凋亡实现对细胞生物学行为的调控，国外有学者通过研究发现，KLF5可通过激活c-Jun氨基末端激酶上游关键性激酶促进食管癌细胞凋亡[10].近年来有学者研究发现KLF5协同其他因子可促进胃癌的发生发展[11].本研究采用HpSlyD诱导胃黏膜细胞，观察干扰KLF5表达对GIM发生的作用机制，结果显示 KLF5、Wnt3a mRNA和蛋白表达量在肠化生组织中明显升高，提示KLF5可能在GIM发生过程中起着重要作用.进一步研究发现HpSlyD可促进细胞GES1细胞增殖、并抑制凋亡，而干扰KLF5表达后可抑制HpSlyD对细胞增殖、凋亡的影响.有研究发现，KLF5可促进乳腺癌细胞增殖、迁移等恶性生物学行为，并促进癌症的发展，与本研究结果一致[12].

图3 各组细胞GES1细胞凋亡情况.

图4 Western blot法检测VIL1、TFF2、CDX2蛋白表达.VIL1:绒毛蛋白1、TFF2:三叶因子Ⅱ、CDX2尾侧同源盒因子2.

VIL1是一种重要的细胞支架蛋白，可使肌动蛋白成束聚集在微绒毛组成结构上，在肠化生组织中可以检测到VIL1表达上调，其在炎性疾病和肿瘤发生过程中发生了质和量的改变[13].有研究发现VIL1为CDX2转录调控的靶基因，CDX2可直接促进多种肠细胞特异因子转录表达，两者在GIM发生过程中发挥着非常关键的作用.TFF主要功能为保护黏膜并促进修复.VIL1、CDX2、TFF为肠上皮化生的标志蛋白[14].本研究结果显示，干扰KLF5表达可抑制HpSlyD对VIL1、TFF2、CDX2 mRNA和蛋白的上调作用.越来越多的研究表明Wnt信号通路参与肿瘤的发生发展过程，Wnt蛋白为细胞分泌的一类的蛋白质，过度表达可产生致癌作用[15，16].本研究结果显示，Wnt激动剂干预后，干扰KLF5 表达对Wnt3a、β-catenin、CDX2 mRNA的影响被抑制，提示KLF5 可能通过Wnt/β-catenin通路促进HpSlyD诱导的肠上皮化生.

4 结论

综上所述，干扰KLF5表达可显著抑制HpSlyD诱导的胃黏膜化生的发生，KLF5可能通过激活Wnt/β-Catenin促进HpSlyD诱导的胃黏膜化生，为胃癌的临床预防提供了新的靶点.

文章亮点

实验背景

Krüppel样因子5(krüppel-like factor 5，KLF5)基因在多种肿瘤组织中表达水平上调，发挥促癌基因的作用，但其在胃癌中作用机制目前尚不十分清楚.研究表明，沉默干扰KLF5可以通过调节Wnt/β-catenin通路抑制结肠癌细胞的生长、迁移和侵袭，但KLF5是否调节Wntβ-catenin通路影响胃黏膜肠化生细胞生物学特性尚不清楚.

实验动机

本研究拟明确KLF5基因是否通过调节Wntβ-catenin通路促进胃黏膜肠化生细胞增殖、抑制细胞凋亡，旨在阐明KLF5基因在胃癌及胃黏膜化生的作用机制.

实验目标

本研究结果显示沉默干扰KLF5基因可抑制GES1细胞增殖，促进细胞凋亡，进一步明确了KLF5基因的功能，为动物实验、临床实验提供了基础.

实验方法

体外培养胃黏膜上皮细胞GES1，构建沉默干扰KLF5的GES1细胞，采用MTT法、流式细胞仪分别检测沉默干扰KLF对细胞增殖、凋亡情况，采用RT-PCR法检测肠化生和Wnt β-catenin通路相关基因的表达.Western blot法检测肠化生相关蛋白的表达.

实验结果

KLF5在胃黏膜肠化生组织中表达上调，沉默干扰KLF5可抑制GES1细胞增殖，并促进细胞凋亡，抑制肠化生相关基因和蛋白的表达，Wnt激动剂干预后，沉默干扰KLF5表达Wnt β-catenin通路相关基因表达的影响被抑制.

实验结论

沉默干扰KLF5可抑制Wnt β-catenin通路，抑制胃黏膜上皮细胞GES1增殖，并促进细胞凋亡.

展望前景

本研究仅初步证实KLF5在胃黏膜肠化生的作用可能与调节Wnt β-catenin通路有关，在未来的研究中，我们将继续探索KLF5与Wnt β-catenin通路特异性结合的相关分子靶向，并通过免疫组化等技术进一步提高说服力.