Hp感染性胃癌患者外周血单核细胞TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的变化及其临床意义

王 洋，邹新梅，潘琴梅，钟丽萍

王洋，邹新梅，潘琴梅，湖州市第三人民医院呼吸消化科 浙江省湖州市313000

钟丽萍，湖州市中心医院肿瘤内科 浙江省湖州市 313000

0 引言

胃癌是目前临床当中较常见、发病率较高的一种恶性肿瘤疾病，在我国各类恶性肿瘤中发病率居首位[1].既往临床试验证实[2]，诱发胃癌起病的因素较多，其中幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H.pylori)感染与其发生及进展密切相关.H.pylori可介导CagA基因及对上皮细胞保护层具穿透能力的HtrA的蛋白酶等毒性因子表达和参与激活胃黏膜组织免疫及炎症反应，进一步通过逃避肿瘤免疫以及促使生成新血管等途径对肿瘤细胞的转移、浸润、生长及血管生成等产生驱动作用.然而，整个过程当中所涉及的相关免疫细胞及细胞因子没有完全明确，因此对于H.pylori感染性胃癌患者发病机制的深入研究对病情诊断、治疗以及预防均具有重大意义[3].近些年研究发现[4，5]，TLR4作为固有免疫系统识别病原相关分子模式的主要受体之一，与H.pylori识别和癌前病变密切相关，且其信号通路上的其它重要分子NF-κB和MyD88也同样被认为参与了癌前病变的发生.然而，现阶段临床对TLR4/MyD88/NF-κB信号通路分子变化的研究多集中于免疫及炎症机制中所发挥的作用[6，7]，而关TLR-4、NF-κB和MyD88分子的这种变化是否与胃癌患者H.pylori感染之间存在相关性尚不明确，为此，本研究通过探讨TLR-4、NF-κB和MyD88分子在H.pylori感染性胃癌患者外周血单核细胞中的表达，以期为临床预防和针对性治疗提供理论依据.

1 材料和方法

1.1 材料 选取2017-10/2020-10于我医院收治的80例胃癌患者作为研究组，纳入标准:(1)均在术后经病理检查确诊为胃癌[8]; (2)半年内未用免疫调节剂进行治疗者; (3)入组前4 wk未进行抗H.pylori治疗; (4)血液标本取材前未行放疗、化疗及生物治疗; (5)患者及家属均自愿参加并签署知情同意书.排除标准:(1)入院前1 mo曾服用过对指标检测结果可能产生影响的药物; (2)正在参与其他医学研究者; (3)临床资料不全，如病理分型不明、临床数据缺失过多等; (4)合并其他恶性肿瘤性疾病; (5)合并相关病毒、细菌和真菌感染者.研究组患者中，男性45例，女性35例; 年龄在30-75岁，平均年龄为(49.95±7.87)岁.另外选择同期来我院进行体检且体检结果合格的50例健康者作为对照组，其中男性27例，女性23例; 年龄在31-74岁，平均年龄为(49.87±7.65)岁.上述对象均未发生病例脱落，两组研究对象基线资料差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性.

1.2 方法

1.2.1 TLR4/MyD88/NF-κB信号通路相关分子检测:患者于入院时、健康体检者入组时次日6:00时空腹抽取外周静脉血2 mL，外周血加入红细胞裂解液200 μL，3000 r/min、4 ℃条件进行离心，去除细胞核和少数未破碎的细胞产生的沉淀，随后取上清高速离心获得细胞膜沉淀和含有细胞浆蛋白的上清，然后通过优化的膜蛋白抽提试剂(Abbkine Scientific Co.，Ltd.，货号:KTP3005)从沉淀中抽提获取膜蛋白.采用Partec流式细胞术测定患者外周血单核细胞中TLR-4、NF-κB和MyD88蛋白的表达情况，检测仪器为德国Partec公司生产的CyFlow®Cube8流式细胞仪.主要试剂为藻红蛋白标记的TLR-4单克隆抗体(上海康朗生物科技有限公司，货号:kl753Bo21)、别藻青蛋白标记的NF-κB单克隆抗体(上海泽叶生物科技有限公司，货号:ZYR824Ra01)、MyD88多克隆抗体(美国Cedarlane公司，货号:CLAS05-056)及其相应的同型对照抗体.所有操作均根据试剂说明书进行.

1.2.2H.pylori抗体的定性检测:采用C-14呼气试验和改良Giemsa染色判定所纳入胃癌者H.pylori感染的情况，改良Giemsa染色:取适量石蜡切片，厚度4 μm，10%的福尔马林进行固定，常规脱水及石蜡包埋处理置入2%的Giemsa染色剂中进行染色，在油镜下(×1000)观察，胃小凹及腺腔有“S”形分布的红色颗粒则为H.pylori阳性.C-14呼气试验:餐后3 h以上或者空腹进行检查，患者服用检测胶囊之后，收集100 mL呼出气体，采用C-14红外线能谱仪(德国费雪分析仪器公司产品)进行判定，若其DOB值大于2.5则为H.pylori阳性.若C-14呼气试验和改良Giemsa染色两种方法中任一实验结果显示为阳性的判定为H.pylori感染阳性，两种方法均为阴性的则判定为阴性.

统计学处理利用SPSS 20.0软件分析，计量资料经正态性检验符合正态性分布，以mean±SD表示.进行两两比较时采用Dunnet-t检验，组间各指标比较采用单因素方差分析.计数资料采用率(%)表示，应用χ2检验分析.胃癌患者H.pylori感染与TLR4/MyD88/NF-κB信号通路相关分子表达之间的相关性采用Pearson相关性分析.

2 结果

2.1 两组TLR4/MyD88/NF-κB信号通路相关分子比较与对照组相比较，研究组TLR-4、NF-κB、MyD88表达均明显偏高，差异均有统计学意义(P＜0.05).见表1.

2.2 不同病理特征胃癌患者TLR4/MyD88/NF-κB信号通路相关分子 胃癌患者不同临床分期、是否出现淋巴结转移和不同浸润深度的TLR4/MyD88/NF-κB信号通路相关分子表达比较，差异均有统计学意义(P＜0.05); 而不同性别、年龄的TLR4/MyD88/NF-κB信号通路相关分子表达比较，差异无统计学意义(P＞0.05).见表2.

2.3 胃癌H.pylori感染患者TLR4/MyD88/NF-κB信号通路相关分子比较 与H.pylori感染阴性相比较，H.pylori感染阳性TLR-4、NF-κB、MyD88表达均明显偏高，差异均有统计学意义(P＜0.05).见表3.

表1 两组TLR4/MyD88/NF-κB信号通路相关分子比较(mean±SD，%)

表2 两组TLR4/MyD88/NF-κB信号通路相关分子比较(mean±SD，%)

2.4 胃癌患者H.pylori感染与TLR4/MyD88/NF-κB信号通路相关分子表达之间的相关性 Pearson检验发现，H.pylori感染与TLR-4、NF-κB、MyD88表达之间有正相关(r=0.726、0.684、0.631，P＜0.01).

3 讨论

世界卫生组织国际癌症研究机构认为H.pylori是导致胃癌发生发展的I类致癌因素，H.pylori感染后可引起胃黏膜的炎症反应，导致细胞发生增殖及凋亡异常，促进肠化和萎缩，进而加快“正常胃黏膜-慢性萎缩性胃炎-不典型增生-胃癌”这一癌病进程[9].既往亦有大量临床研究证实[10-12]，胃癌患者血清及组织中H.pylori感染率均高于正常人群，且其机体内相关免疫、炎症因子表达处于异常状态.因此，探究与H.pylori感染性胃癌发生、发展有关的标志物对于大规模筛查胃癌、早期诊断并及时治疗均具有重要意义[13].

目前疾病监测手段的不断更新，更多的血清生物标记物应运而生，关于TLR4/MyD88/NF-κB信号通路与结直肠癌[14]、乳腺癌[15]和肝癌[16]等多种恶性肿瘤的关系研究已有一些报道，大多专家学者研究发现这些恶性肿瘤患者外周血单核细胞中的TLR-4、MyD88、NF-κB水平均显著升高的现象，同时还发现这种升高与炎性介质白细胞介素和血管内皮生长因子等呈现正相关，亦与疾病的严重程度密切相关[17].有研究发现[18]，TLR4和MyD88在大肠癌组织中的含量相较于其癌旁组织中的含量明显偏高，且与患者的临床病理特征密切相关.张子杰等[19]研究显示，肝细胞癌组织中TLR4通路功能明显增强，且其高表达可促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移.此类临床报告都直接指明TLR4/MyD88/NF-κB信号通路在恶性肿瘤发生发展中具有重要作用[20].然而，现阶段临床关注的焦点最集中在发病率较高的结直肠癌、乳腺癌，对于TLR4/MyD88/NF-κB信号通路在H.pylori感染性胃癌中所扮演角色却鲜有报道.本研究结果显示，研究组TLR-4、NF-κB、MyD88表达明显高于对照组，且H.pylori感染阳性者TLR-4、NF-κB、MyD88表达亦高于H.pylori感染阴性，同时胃癌患者不同临床分期、是否出现淋巴结转移和不同浸润深度的TLR-4、NF-κB、MyD88表达比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)，这就提示了TLR4/MyD88/NF-κB信号通路激活不仅可能与胃癌H.pylori感染的发生有关，且与H.pylori感染性胃癌患者的临床病理进程密切相关.另外，进一步行一元线性回归分析发现，H.pylori感染与TLR-4、NF-κB、MyD88表达之间有正相关(r=0.726、0.684、0.631，P＜0.01)，提示TLR4/MyD88/NF-κB信号通路相关分子表达水平能够客观反映胃癌患者的H.pylori感染情况，并且可考虑用于评价胃癌的严重程度.

表3 两组TLR4/MyD88/NF-κB信号通路相关分子比较(mean±SD，%)

4 结论

综上所述，胃癌患者外周血单核细胞中的TLR4/MyD88/NF-κB信号通路相关分子表达水平均显著升高，且不同病理特征及参数分组下的TLR4/MyD88/NF-κB信号通路相关分子表达水平存在显著差异，推测H.pylori感染可能通过诱发TLR4/MyD88/NF-κB信号通路异常表达参与了胃癌的发生及发展.然而，本研究也有一定的局限性，如:(1)未能完全控制药物使用等混杂因素对结果的干扰; (2)纳入病例来源单一，且缺少预后方面的分析;(3)医院条件有限使得样本量不够充足; 这些都可能是结果的潜在影响因素，因此，我们下一步的工作方向是进一步设置高质量的前瞻性实验，以期对本文实验结果进行进一步的论证与支持.但即便有这些不足之处，本文数据亦对临床探讨H.pylori感染性胃癌发病机制和指导临床工作具有重要意义.

文章亮点

实验背景

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H.pylori)感染和胃癌的发生发展密切相关.H.pylori可能通过两个方面引起细胞癌变:一方面H.pylori本身产生的细胞毒素具有致突、致癌作用，直接作用于感染部位后引起细胞恶变;另一方面幽门螺旋杆菌感染导致的一个活跃的炎症微环境.TLR4/MyD88/NF-κB信号通路异常参与调控机体内多种炎性反应，与肿瘤细胞的增殖、调亡等存在密切关系，提示TLR4/MyD88/NF-κB信号通路可能在胃癌发病机制中发挥重要作用.

实验动机

H.pylori感染可加重胃黏膜的炎症反应，促进肠化和萎缩，进而加快癌变，同样，近年来的研究报告也发现，TLR4通过激活MyD88依赖性途径促进上皮修复，而TLR4介导的修复作用也可能导致肿瘤进展，但TLR4/MyD88/NF-κB信号通路是否与胃癌患者H.pylori感染之间也存在相关性，临床相关研究较少，值得进一步研究.

实验目标

探讨TLR-4、NF-κB和MyD88分子在H.pylori感染性胃癌患者外周血单核细胞中的表达，证实其是否可客观反映胃癌患者的H.pylori感染情况，或者可考虑用于评价胃癌的严重程度.

实验方法

选取符合入选标准的80例胃癌患者作为研究组，另外选择同期来我院进行体检且体检结果合格的50例健康者作为对照组.比较两组受试者、不同病理特征胃癌患者以及胃癌H.pylori感染患者外周血单核细胞中TLR-4、NF-κB和MyD88蛋白表达水平，并分析胃癌患者TLR-4、NF-κB和MyD88蛋白水平与H.pylori感染的相关性.

实验结果

胃癌患者外周血单核细胞中的TLR4/MyD88/NF-κB信号通路相关分子表达水平均显著升高，且不同病理特征及参数分组下的TLR4/MyD88/NF-κB信号通路相关分子表达水平存在显著差异.

实验结论

H.pylori感染可能通过诱发TLR4/MyD88/NF-κB信号通路异常表达参与了胃癌的发生及发展，监测其水平变化对于大规模筛查胃癌、早期诊断并及时治疗均具有重要意义.

展望前景

我们下一步的工作方向可能分为几个方面:(1)在整个研究环节精细控制药物使用等混杂因素对结果的干扰; (2)对所纳入对象进行有效随访，探究TLR4/MyD88/NF-κB信号通路在胃癌H.pylori感染患者预后判断中的应用价值; (3)扩大样本容量并进行多中心取样，进一步设置高质量的前瞻性实验，以期对本文实验结果进行进一步的论证与支持.