原卟啉Ⅸ在HBV 相关肝硬化中的临床意义

成若晨，张 璎，何腾飞，郭 蕊

（西安医学院临床医学院，陕西 西安 710021）

我国的肝硬化（liver cirrhosis）主要病因为乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染引起，感染率为77%[1]。其病理过程为慢性炎症、脂肪样变性、肝细胞减少、弥漫性纤维化及肝内外血管增殖，逐渐发展为肝硬化。阻断肝硬化关键在于早期的预警、干预及评估，目前血清肝纤维化及肝硬化的影像检测主要集中在肝纤维化及肝硬化阶段，虽然肝脏病理活检可以反映慢性炎症、脂肪样变性的早期阶段，但因其为有创操作，在临床应用受到一定的限制。慢性肝病存在卟啉代谢异常[2]，主要机制为HBV 感染损伤肝细胞线粒体并出现卟啉代谢异常。卟啉与HBV相关慢性肝病进展的关系及其能否用于肝损害的早期预警及病情评估，目前的研究报道较少。为此，本文拟研究原卟啉Ⅸ（Protoporphyrin Ⅸ，PPⅨ）在HBV 相关肝硬化中的表达情况及其临床意义。报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2018 年10 月～2019 年10 月就诊于西安医学院第一附属医院的51 例HBV 相关肝硬化患者作为肝硬化组，所有患者均符合《慢性乙型肝炎防治指南（2019 年版）》[1]有关肝硬化的诊断标准。另外选取同期健康者40 例作为对照组。肝硬化组中男性34 例，女性17 例，年龄30～83 岁，平均年龄（50.74±13.08）岁；对照组男性24 例，女性16例，年龄23～86 岁，平均年龄（48.65±15.98）岁。两组年龄、性别比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本实验得到我院伦理委员会的批准，所有研究对象均同意参与本研究并签署知情同意书。

1.2 方法 采用高效液相色谱法（HPLC）检测血样原卟啉Ⅸ浓度。首先用N，N-二甲基甲酰胺（DMF）溶液配制不同浓度原卟啉Ⅸ标准品100、70、30、10、7、3、1 ng/dl，绘制横坐标原卟啉浓度（ng/dl）与纵坐标峰面积（U×S）的标准曲线：Y=0.2464X+0.3086，R2=0.9998，见图1。样本处理：解冻取血清样品300 μl加700 μl 甲醇定容至1 ml，震荡、冷冻高速离心离心，取上清液，高效液相色谱仪测定，每份样品进样3 次取均值。根据标准曲线计算被检测者血样原卟啉Ⅸ浓度，高效液相色谱仪检测原卟啉Ⅸ标准品、血样的出峰图像，见图2。

1.2.1 常规检测及检查 常规实验室检测均在本院检验科完成，包括HBV-DNA 定量、AFP、血常规、肝功、凝血功能等血清学指标。

1.2.2 血清PPⅨ检测 两组研究对象禁食、禁水12 h后，清晨空腹采集5 ml 外周静脉血避光离心，取上清液分装于1.5 ml 棕色避光EP 管中-80 ℃冻存。血清PPⅨ检测采用高效液相色谱法（HPLC），在西安医学院药物分析测试中心完成。主要仪器试剂：安捷伦1260 高效液相色谱仪、配套二元泵、荧光检测器以及数据处理软件工作站（Agilent，美国）色谱柱（美国Agilent 5 TC-C18），色谱柱（250×4.6 mm，5 μm）。原卟啉Ⅸ标准品（购自上海源叶生物公司），色谱条件：柱温30 ℃，流动相：A 纯净水（含5%冰乙酸），B甲醇：乙腈：DMF=45:45:10，以B:A=95:5 等度洗脱，流速1 ml/min，激发波长400 nm，发射波长630 nm，增益16。

图1 原卟啉检测标准曲线

图2 高效液相色谱仪检测不同标本中原卟啉Ⅸ出峰图像

1.3 观察指标 比较肝硬化组Child-Pugh A、B、C 各级患者及对照组血清原卟啉Ⅸ水平，分析不同肝功能分级患者血清原卟啉Ⅸ的差异，评估血清原卟啉Ⅸ对于乙肝肝硬化肝功能损害及抗HBV 疗效的评估作用。

1.4 统计学方法 统计软件包括SPSS Statistic 22.0和GraphPad prism 8.0。HBV-DNA 取LOG 值进行转换。使用Shapiro-Wilk 检验方法进行正态检验，符合正态分布的计量资料采用（）标准，对比行t检验；不符合正太分布的计量资料采用[M（P25，P75）]表示，两样本独立对比行Mann-WhitneyU检验，配对样本比较行Wilcoxon 检验；相关性采用Spearman相关分析法；采用GraphPad prism 作图工具进行统计绘图。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清原卟啉Ⅸ水平比较 治疗前，肝硬化组患者血清PPⅨ为[66.51（49.26，90.52）]ng/dl、健康对照组为[15.43（10.87，20.16）]ng/dl，差异有统计学意义（Z=-7.400，P＜0.05）。

表1 肝硬化组Child-Pugh A、B、C 各级患者及对照组血清PPⅨ水平比较[M（P25，P75），ng/dl]

2.2 肝硬化组Child-Pugh A、B、C 各级患者及对照组血清PPⅨ水平比较 肝硬化组Child-Pugh A、B、C各级患者PPⅨ水平均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；肝硬化组Child-Pugh A 级患者PPⅨ水平高于B、C 级，差异有统计学意义（P＜0.05），而Child-Pugh B、C 级患者PPⅨ水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1、图3。

2.3 血清PPⅨ与肝纤维化评分、实验室指标的相关性分析 肝硬化患者血清PPⅨ水平与Child-Pugh评分、APRI 评分、FIB-4 评分、TBIL、AST、ALT、ALB、PLT、PT 均具有相关性（P＜0.05），与HBVDNA、ALP、GGT 无相关性（P＞0.05），见表2。

图3 肝硬化组Child-Pugh A、B、C 各级患者及对照组血清PPⅨ水平比较

表2 血清PPⅨ与肝纤维化评分、实验室指标的相关性分析

2.4 血清PPⅨ和肝功能指标评估肝硬化Child-Pugh评分的效能 Child-Pugh＞7 分时，PPⅨ评估Child-Pugh 评分的曲线下面积（AUC）为0.853，临界值62.05 ng/dl，灵敏度86.20%，特异度75.00%，95%CI：0.781～0.952；TBIL 的AUC 为0.869，临界值29.99 ng/dl，灵敏度75.90%，特异度91.10%，95%CI：0.775～0.962；AST 的AUC 为0.800，临界值39.85 ng/dl，灵敏度75.90%，特异度21.80%，95%CI：0.710～0.891；ALT 的AUC 为0.675，临界值40.9 U/L，灵敏度65.50%，特异度 31.50%，95%CI：0.567～0.783。PPⅨ评估肝硬化Child-Pugh 评分的灵敏度高于TBIL，特异度低于TBIL，见图4。

图4 血清PPⅨ与肝功能指标评估Child-Pugh 评分的效能

2.5 血清原卟啉Ⅸ对抗HBV 疗效的评估作用 肝硬化组治疗前、治疗12、24 周后，患者血清PPⅨ、TBIL水平依次降低，差异有统计学意义（P＜0.05），HBVDNA、AST、ALT、ALB、PT 水平与治疗前比较，差异有统计学意义（P＜0.05），治疗前后PLT、ALP、GGT 水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表3、图5。

表3 血清原卟啉Ⅸ对抗HBV 疗效的评估作用[M（P25，P75）]

图5 血清原卟啉Ⅸ对抗HBV 疗效的评估作用

3 讨论

PPⅨ是卟啉化合物中最重要的一种，作为血红素合成的前体，其广泛存在于各细胞中。肝细胞是卟啉合成代谢的主要场所，在线粒体和胞浆内进行，参与细胞色素P450 的合成，当肝细胞功能障碍时可能影响血红素和卟啉的代谢。氨基γ 酮戊酸合成酶（aminolevulinic acid synthase，ALAS）是血红素和PPⅨ合成过程中主要的限速酶，某些药物可以激活肝细胞内ALAS 表达，使PPⅨ在肝胆中内积聚造成损伤[3]。当各种内源性或外源性因素导致肝细胞破坏，干扰血红素的合成和PPⅨ的体内平衡，使血红素对ALAS 抑制作用降低[4]，大量的PPⅨ具有肝毒性，会导致肝细胞和胆管细胞等一系列组织损害[5]。一旦肝损伤发生，肝脏对PPⅨ的清除作用进一步减弱，血浆和红细胞中PPⅨ水平可逐渐升高[3]。

本研究发现，肝硬化组PPⅨ水平高于对照组，且肝硬化组Child-Pugh A、B、C 各级患者PPⅨ水平均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），提示肝硬化时PPⅨ升高且与肝功能损害一致。这可能与PPⅨ在线粒体和胞浆代谢，而HBV 感染引起肝细胞线粒体的破坏以及肝硬化本身相关肝细胞破坏假小叶形成导致血红素合成障碍及前体PPⅨ积累有关。PPⅨ是一种内生的光敏剂，因此本实验血清取样及保存均避光进行，体内PPⅨ在适合光能和氧气作用下，会产生活性氧（ROS），可通过蛋白质、DNA和脂质损伤导致细胞毒性，也可攻击线粒体和细胞膜导致细胞凋亡和坏死[2]，因此肝硬化也可出现卟啉代谢异常。另外，研究发现肝硬化组Child-Pugh A级患者PPⅨ水平高于B、C 级，差异有统计学意义（P＜0.05），而Child-Pugh B、C 级患者PPⅨ水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05），这可能与病情加重后肝细胞内原卟啉Ⅸ积累有关，也可能与纳入研究的Child-Pugh C 级患者数量较少有关。既往有研究发现肝病患者原卟啉峰高于对照组，与肝功能损害呈正相关，并且认为肝病患者卟啉变化较常规肝功能检测出现的更早、敏感性更高[2]。有学者对不同原因肝硬化患者的卟啉代谢进行研究，认为卟啉代谢紊乱是评价肝功能的负面因素，可以动态评估肝脏功能，作为肝硬化Child-Pugh 分级附加诊断及预后指标。对病毒相关肝病患者尿便中卟啉进行检测，发现肝硬化患者尿便卟啉排泄均较高，并且这种现象在HCV 感染患者中更常见[6]。但这些研究并未单独对乙肝相关疾病进行探讨，本研究发现，HBV 引起肝细胞损害时可影响卟啉代谢，患者血清PPⅨ升高，可能因为HBV 感染肝细胞后其X 蛋白对肝细胞线粒体损害，进而影响血红素的合成，使PPⅨ在体内积累，引起肝细胞的二次损害，同时PPⅨ清除进一步减少，损害持续加重。肝脏是卟啉代谢的场所，但机体只有15%的卟啉合成发生在肝脏中，因此尽管肝脏疾病可引起卟啉代谢异常，但其积累程度又不会引起相关临床症状[7]。

本次研究显示，当PPⅨ浓度大于62.05 ng/dl时，可以区分Child-Pugh 评分＞7 分的患者，相比TBIL、AST、ALT 具有较高的灵敏度，但其特异度较TBIL 低。肝硬化的病理表现是肝细胞变性坏死、纤维组织增生结节再生，而肝细胞坏死程度与卟啉代谢相关，肝损害越重卟啉代谢异常越明显[8]，这可能也是本次发现肝硬化患者血清原卟啉高于正常人，Child-Pugh B、C 级高于A 级的原因，说明PPⅨ与肝功能损害密切相关。

HBV 病毒可能影响肝细胞内卟啉的代谢和血红素的合成[5]，本次研究发现，治疗后肝硬化患者PPⅨ及肝功能指标均较前好转，PPⅨ与Child-Pugh 评分、总胆红素、白蛋白呈相关性；HBV 载量与PPⅨ呈剂量依赖性降低，PPⅨ、胆红素呈时间依赖性降低。在HCV 合并活动性迟发性卟啉病（porphyria cutanea tarda，PCT）患者的抗HCV 治疗后发现血清卟啉较前下降[9，10]。HBV 抗病毒治疗可以降低血清中PPⅨ水平，可能与抗病毒治疗减轻肝细胞内炎性反应，患者肝功能好转有关；也可能与HBV 核心蛋白可引起FLVCR1 和ABCG2 蛋白表达增高、ABCB6 蛋白表达降低，使细胞出现卟啉代谢紊乱有关[11]。HCV 核心蛋白同样可使FLVCR1 和ABCG2蛋白表达增高，使细胞内PPⅨ、血红素减少[6]，二者的机制相似，通过抗病毒治疗后，HBV、HCV 载量均降低。FLVCR1 蛋白是转运蛋白超家族成员之一，属于输出性蛋白，可以将PPⅨ转运至细胞外[11]，ABCG2 蛋白也可以将PPⅨ转运至细胞外，ABCB6蛋白位于线粒体外膜，是线粒体摄取卟啉的必须蛋白，ABCB6 表达降低也可能使PPⅨ向线粒体内转运减少。因此，HBV 相关肝硬化患者血清PPⅨ高于健康对照组可能与HBV 核心蛋白向细胞外转运卟啉蛋白表达增高、向细胞内转运卟啉蛋白表达减少有关。

本研究不足之处：研究样本量较少、随访时间短，需要多中心、大样本研究进一步阐明Ⅸ对乙肝肝硬化患者的临床意义。本课题仅对肝硬化患者肝功能与PPⅨ的相关性及可能的作用机制进行初步探讨，并未进行深入研究。后期将进一步探讨卟啉病患者、药物性肝损害、肝衰竭与PPⅨ的关系，以及肝细胞内、胆汁内PPⅨ水平，以更科学、全面的了解PPⅨ的作用机制。

综上所述，肝硬化患者原卟啉Ⅸ水平高于健康人群，该指标可作为评估乙肝肝硬化患者肝功能损害的预警因子，也可用于抗HBV 治疗效果的评估。