CBX8基因在肝细胞癌中的表达及功能分析

任冠桦，张朝钧，梅凡彪，蔡冬梅，黄天壬，邓 伟

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)占肝癌的85%～90%，是中国最常见的恶性肿瘤之一[1]。国家癌症中心的最新监测结果表明，我国肝癌发病率居全国恶性肿瘤第4位，病死率居第2位[2]。因此，探索有效的治疗方法，提高肝癌患者的生存率对于保障国民生命健康具有重要意义。近年来随着高通量测序技术的不断进步，肝癌发病的分子机制研究成果斐然，发现了大量的关键基因，为肝癌靶向治疗的发展奠定了坚实的基础。但是，目前已有的肝癌靶向药物，如索拉菲尼、卡博替尼、雷莫芦单抗等，仍有其局限性[3～5]。因此寻找新的与肝癌相关的基因和分子标志物具有重要意义。色素框同源蛋白8(chromobox 8,CBX8)又名人多梳蛋白3(Polycomb 3,PC3)，由位于人类染色体17q25.3上的CBX8基因编码产生，全长共9 552 bp[6]。CBX8是PcG蛋白家族的重要组成部分，与细胞周期、分化、修复和衰老的调节关系密切[7，8]。CBX8在许多肿瘤组织中呈高表达，例如乳腺癌[9]、食管癌[10]和结直肠癌[11]等。有研究[12]表明，CBX8在HCC组织中过表达，并与HCC的不良预后关系密切，细胞学和动物实验均证实CBX8可促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移，对HCC的预后和疗效判断具有一定的意义。本文结合生物信息学分析方法，利用GEPIA、COSMIC、String、UALCAN、HPA等数据库对CBX8进行深入挖掘，旨在分析CBX8在HCC中的表达和潜在的临床意义，为探究HCC发生发展的分子机制提供新的线索。

1 资料与方法

1.1资料收集 在GEPIA2数据库(http://gepia2.cancer-pku.cn)、COSMIC数据库(https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic)、UALCAN数据库(http://ualcan.path.uab.edu)、HPA数据库(https://www.proteinatlas.org)中收集人HCC的研究数据，并筛选出在HCC组织中CBX8的表达数据及其相关资料。

1.2分析方法

1.2.1 CBX8基因mRNA表达水平分析 通过GEPIA2数据库对TCGA和GTEx项目中CBX8基因进行检索，设置筛选条件：(1)Expression Analysis：Expression DIY。(2)fold change：1；p-value Cutoff：0.01。(3)Cancer name：LIHC。共获得369例HCC组织和160例正常肝组织的mRNA表达信息。应用“Box Plot”和“Stage Plot”模块分析CBX8基因在HCC中的表达水平及其与癌症分期的关系。

1.2.2 CBX8基因突变的情况分析 通过COSMIC数据库分析CBX8基因突变的情况，其中满足点突变情况分析的HCC样本177例，满足基因突变情况分析的HCC样本259例。应用“Overview”和“Mutation distribution”选项分析CBX8的三维结构和突变分布情况。

1.2.3 CBX基因的表达水平与人口学特征、病理特征的关联性分析 通过UALCAN数据库检索CBX8在HCC组织和正常组织中的表达情况。根据不同特征将其分成不同亚组，分析CBX8基因表达水平与不同亚组的关联性。应用“Expression”选项查看不同亚组下表达情况的结果图。

1.2.4 CBX8基因表达水平与HCC患者生存预后的关联性分析 通过GEPIA2数据库对TCGA和GTEx项目中CBX8基因进行检索，设置筛选条件：(1)Expression Analysis：Survival Analysis。(2)Group Cutoff=Median；Hazards Ratio(HR)=Yes；95% Confidence Interval=Yes；Cutoff-High(%)=50，Cutoff-Low(%)=50。(3)Cancer name：LIHC。经筛选后，共有364例HCC样本满足条件，以表达水平的中位数为标准将HCC样本划分为高表达组(182例)和低表达组(182例)。应用“Overall Survival”和“Disease Free Survival”分析CBX8基因表达水平与患者生存预后的关系。

1.2.5 CBX8基因蛋白表达水平分析 通过HPA数据库从RNA和蛋白水平研究人类不同组织和器官中的蛋白表达情况，用Tissue Atlas和Pathology Atlas分别查看CBX8在正常肝组织和HCC组织中的免疫组化图像。

1.2.6 CBX8相关蛋白互作网络构建及通路分析

应用String蛋白互作网络分析数据库(https://string-db.org)对CBX8蛋白及其互作网络进行检索，分析与CBX8蛋白相互作用的所有蛋白构成的网络和调控关系。对CBX8进行富集通路分析，以P<0.05作为功能和通路富集显著的标准进行筛选，预测与CBX8影响HCC发生发展的通路。

2 结果

2.1HCC组织和正常肝组织CBX8 mRNA表达水平比较 GEPIA2数据库分析结果显示，HCC组织的CBX8 mRNA表达水平显著高于正常肝组织(P<0.05)。进一步对HCC组织CBX8 mRNA的表达水平与癌症分期的关联性进行分析，结果显示，CBX8 mRNA在Ⅰ期表达较离散，在Ⅳ期表达较集中，但Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期与Ⅳ期间CBX8 mRNA表达水平比较差异均无统计学意义(F=1.920，P=0.126)。见图1。

ⓐHCC组织和正常肝组织CBX8 mRNA表达水平比较；ⓑHCC组织CBX8 mRNA表达水平与癌症分期的关系

2.2CBX8基因在HCC组织中的突变情况 COSMIC数据库检索CBX8的三维结构及其基因突变情况，结果显示，CBX8基因的点突变类型主要为C>T突变(34.46%)、G>A突变(27.12%)和G>T突变(12.43%)；CBX基因的密码子改变主要为错义突变(50.58%)和同义突变(16.60%)。见图2。

ⓐCBX8的三维结构图；ⓑCBX8基因点突变分布情况；ⓒCBX8基因突变类型分布情况

2.3CBX8 mRNA表达水平与患者人口学特征的关联性分析结果 通过UALCAN数据库探究CBX8 mRNA表达水平与患者人口学特征的关系，结果表明，CBX8 mRNA在不同性别、年龄和种族的HCC患者中的表达差异均无统计学意义(P>0.05)。CBX8 mRNA表达水平与患者体重呈负相关，正常体重组CBX8 mRNA表达水平显著高于肥胖组和极度肥胖组(P<0.05)，但其余组间差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

ⓐCBX8 mRNA表达水平与患者性别的关联分析；ⓑCBX8 mRNA表达水平与患者种族的关联分析；ⓒCBX8 mRNA表达水平与患者年龄的关联分析；ⓓCBX8 mRNA表达水平与患者体重的关联分析

2.4CBX8 mRNA表达水平与HCC病理特征的关联性分析结果 通过UALCAN数据库分析CBX8 mRNA表达水平与HCC病理特征的关系，结果表明，TP53突变组的CBX8 mRNA表达水平显著高于非TP53突变组(P<0.05)；HCC组的CBX8 mRNA表达水平显著低于纤维板层型HCC组(P<0.05)，但肝胆管混合型HCC组的CBX8 mRNA表达水平与HCC组和纤维板层型HCC组比较差异无统计学意义(P>0.05)；CBX8 mRNA表达水平在N0期与N1期中比较差异无统计学意义(P>0.05)；肿瘤1级组和3级组CBX8 mRNA表达水平差异有统计学意义(P<0.05)，但肿瘤1级组、2级组、3级组和4级组的其他两两比较中差异均无统计学意义(P>0.05)。见图4。

ⓐCBX8 mRNA表达水平与TP53突变的关联分析；ⓑCBX8 mRNA表达水平与N分期的关联分析；ⓒCBX8 mRNA表达水平与肿瘤组织学分类关联分析；ⓓCBX8 mRNA表达水平与肿瘤分级的关联分析

2.5CBX8 mRNA表达水平与HCC患者的生存预后分析结果 通过GEPIA2数据库生存分析模块对CBX8 mRNA表达水平与HCC患者的生存预后进行分析，结果显示，CBX8 mRNA高表达组在无病生存期比较差异无统计学意义(P=0.200)，但CBX8 mRNA高表达组的总生存期低于低表达组，差异有统计学意义(P=0.023)。见图5。

ⓐ无病生存期；ⓑ总体生存期

2.6CBX8蛋白在正常肝组织与HCC组织中的表达情况 应用HPA数据库中的组织病理表达模块对CBX8特异性抗体(HPA031462)在HCC和正常肝组织中的免疫组化染色强度进行分析，结果显示，在3例正常肝组织中，CBX8蛋白在肝细胞和胆管细胞中均未见染色；在7例HCC组织中，CBX8未染色1例，弱染色3例，中染色3例，CBX8蛋白主要表达于细胞质、细胞核中。表明CBX8蛋白在HCC组织中的表达较正常组织上调。见图6。

2.7CBX8相关蛋白互作网络及相关通路 应用String数据库分析获得与CBX8相关蛋白作用的互作网络(最高置信区间为0.7，数量<10)，P=0.000，节点数为11。与CBX8蛋白互相作用的主要相关蛋白分别为BMI1、PHC1、PHC2、PHC3、RING1、PCGF1、PCGF2、EZH2、RNF2、ENSG00000269897，见图7。进一步的富集分析结果显示，这些蛋白主要参与了细胞周期、组蛋白的调控、锌指蛋白结合、PcG蛋白调控等生理过程，信号通路主要富集在干细胞多能性的信号调控通路和癌症关联的microRNA网络。见表1。

ⓐ正常肝组织(ID3222)；ⓑHCC组织(ID2177)

图7 CBX8相关蛋白互作网络图

表1 CBX8相关蛋白参与的生理过程和富集通路

3 讨论

3.1HCC是常见和病死率较高的恶性肿瘤之一，如何提高HCC患者的生存率仍是世界性的难题[13]。肝脏肿瘤的发生、发展是一个多因素影响的复杂过程，由许多癌症相关基因、蛋白与信号通路参与完成[14]。癌基因的过度表达和抑癌基因的沉默会影响肿瘤的进程。不少文献[15，16]报道，CBX8基因在多种肿瘤中异常表达，且与患者预后具有相关性。目前对CBX8基因虽有初步了解，但其与肝癌的关系尚不清楚，仍需进一步研究。

3.2本研究运用生物信息学方法，探讨肿瘤数据库中CBX8基因表达与HCC的关系，结果发现，HCC组织中的CBX8 mRNA水平和蛋白水平均高于正常肝组织，且CBX8基因的表达越高，患者总生存期越低。2015年Gao等[17]对PcG蛋白研究发现，CBX8蛋白作为PcG1的重要核心蛋白在HCC组织中表达水平显著增加，且CBX8蛋白高表达患者的无病生存期和总存活期均显著低于低表达患者，提示CBX8可作为预测HCC预后的因子。本研究进一步对CBX8的表达水平与人口学特征的关系进行了探讨，结果显示CBX8在HCC患者中的表达与性别、种族、年龄无显著关联性(P>0.05)，与体重显著关联(P<0.05)。对CBX8在不同病理特征HCC患者中的表达水平进行分析，结果发现CBX8的表达与淋巴结转移情况关联不显著(P>0.05)，与TP53突变情况、肿瘤组织学分类、肿瘤分级显著关联(P<0.05)。提示CBX8具有应用于HCC的临床诊断、病情进展和疗效监测的潜在价值。

3.3通过对CBX8的突变情况分析，本研究发现CBX8在HCC中的主要碱基突变类型依次为C>T突变、G>A突变、G>T突变；其引起的密码子改变主要为错义突变，提示CBX8的这些突变可能与HCC的发生发展有一定关系。

3.4本研究进一步通过String数据库对CBX8及其互作蛋白进行挖掘，结果表明CBX8参与了细胞周期、组蛋白的调控、锌指蛋白结合、PcG蛋白调控等生理过程。富集分析结果显示，CBX8相关信号通路为干细胞多能性的信号调控通路和癌症关联的microRNA网络。细胞周期通路的调控在肝癌发生发展中起着重要作用。DNA损伤和损伤后修复可以导致细胞周期阻滞和失调，从而促进恶性肿瘤的发生。Oza等[18]发现CBX8可通过PARP激活在DNA损伤修复中起作用。因此CBX8可能在DNA损伤反应的表观遗传调控中起一定作用，进而影响HCC的发生、发展。另外，Zhang等[19]研究发现CBX8可以通过激活AKT/β连环蛋白途径促进HCC的生长和转移。Xiao等[20]通过体内和体外实验验证了CBX8可能通过与YBX1结合而激活CyclinD1的表达，进而促进HCC细胞增殖，以推进肝癌恶化机制进程。以上研究提示，CBX8可能通过调节细胞增殖、细胞周期相关的基因和信号转导通路而在肝癌细胞的增殖和转移中发挥作用。近期有研究[21]表明，结直肠癌细胞中的CBX8表达下降可导致miRNA表达上调，且CBX8可充当CBX7的同源蛋白发挥RNA结合功能，CBX8/miR-378a-3p/PDIA4途径与结直肠癌恶化相关，提示该途径具有成为治疗靶标的潜在价值。据此推测CBX8在HCC的发生发展中也扮演着重要的角色。

综上所述，本研究利用生物信息学分析的方法探讨了CBX8在HCC组织中的表达水平及其与HCC预后的关系，预测了与CBX8相关的互作蛋白和调控网络，结果提示CBX8可影响HCC的增殖、侵袭和转移的过程，并与预后相关。CBX8有望成为HCC新的分子标志物和治疗靶点，为HCC的预防、诊治和预后提供新思路和方向。