DOK3 PTK7在不同级别结肠腺瘤组织中的表达及意义探讨

孟云超，张启芳，彭家茵，周静雾，邓小丽

Colon cancer; Non-tumor mucosal tissue adjacent to the tumor; Docking protein 3(DOK3); Protein tyrosine kinase 7(PTK7)

结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，在全球范围其发病率已位居所有恶性肿瘤的第3位[1]。晚期结肠癌预后差、病死率高，而早期结肠癌可无任何临床症状，诊出率低。结肠腺瘤是结肠癌的癌前病变，从分子水平研究癌前病变对诊断早期结肠癌具有重要的意义[2，3]。对接蛋白3(docking protein 3,DOK3)为抑癌因子，与多种癌症的发生具有关联性[4]。蛋白酪氨酸激酶7(protein tyrosine kinase 7,PTK7)在许多恶性肿瘤中呈高表达[5]。但目前同时研究DOK3与PTK7在结肠癌前病变中的相关研究仍较少，鉴此，本研究通过收集结肠腺瘤伴低级别异型增生(low-grade dysplasia,LGD)、结肠腺瘤伴高级别异型增生(high-grade dysplasia,HGD)、结肠癌及瘤旁非肿瘤黏膜组织，应用免疫组化法检测其DOK3和PTK7的表达情况，探讨其在结肠癌前病变发展过程中的意义。

1 资料与方法

1.1标本来源 收集2015-01～2018-12广西壮族自治区南溪山医院经病理科确诊的结肠腺瘤标本45例，其中LGD 22例，HGD 23例；收集结肠癌标本22例；收集瘤旁非肿瘤黏膜组织20例。结肠腺瘤标本经结肠镜下高频电切除获得；瘤旁非肿瘤黏膜组织和结肠癌组织经活检钳钳取获得。所有患者术前均未接受过与腺瘤、结肠癌相关的治疗，对此次研究治疗操作知情同意。

1.2主要试剂及仪器 兔抗人PTK7抗体(美国Abcam公司)，兔抗人DOK3抗体(美国abcam公司)；山羊抗兔IgG/辣根酶标记(中杉金桥)；免疫显色试剂(广州安必平医药科技公司)；石蜡切片机(德国Leica公司)；摊片烤片机(湖北欧美莱医疗科技公司)；电热恒温水箱(嘉庆中新医疗仪器公司)；电泳仪(美国伯乐)；光学显微镜(日本Olympus公司)；H1干式恒温仪(珠海黑马医学仪器有限公司)；实时荧光定量PCR仪(美国赛默飞世尔)；超微量紫外分光光度计(美国赛默飞世尔)。

1.3免疫组织化学染色及结果评判 标本经4%甲醛固定常规脱水、石蜡包埋，3 μm切片，常规HE染色。置于0.01 M柠檬酸盐抗原修复液(pH=6.0)加热煮沸修复。滴加少量3%过氧化氢于37 ℃恒温箱孵育，磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)冲洗后擦干玻片，滴加适量抗体(DOK3抗体浓度为1∶100，PTK7抗体浓度为1∶50)，于37 ℃恒温箱孵育1 h，擦干玻片后分别滴加适量二抗，于37 ℃恒温箱孵育30 min后以DAB溶液显色，苏木素染液复染，饱和碳酸锂溶液返蓝，梯度乙醇脱水，干燥，中性树胶封片。以PBS代替一抗作为阴性对照。评判标准[6]：DOK3、PTK7在胞浆和胞膜处表达，以出现浅黄至深棕色为阳性。根据阳性细胞的染色强度(SI)和染色阳性细胞百分数(PP)进行计分。SI:0分，未染色或弱染色；1分，中度染色；2分，强染色。PP:0分，<5%；1分，5%～50%；2分，>50%。根据SI与PP之和确定蛋白表达水平：0～2分为低表达；3～4分为高表达。

1.4统计学方法 应用SPSS20.0统计软件进行数据分析，计数资料以例数(百分率)[n(%)]表示，组间比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1不同类型组织DOK3表达情况比较 DOK3主要表达于腺上皮的胞浆和胞膜。四种不同类型组织的DOK3表达情况差异有统计学意义(P<0.05)。瘤旁非肿瘤黏膜和LGD组织的DOK3高表达率均显著高于HGD和结肠癌组织(P<0.05)；HGD组织的DOK3高表达率也显著高于结肠癌组织(P<0.05)。见表1，图1。

表1 不同类型组织DOK3表达情况比较[n(%)]

图1 四种不同类型组织DOK3表达情况(免疫组织化学染色，×400)

2.2不同类型组织PTK7表达情况比较 PTK7主要表达于腺上皮的胞浆和胞膜。四种不同类型组织的PTK7表达情况差异有统计学意义(P<0.05)。结肠癌和HGD组织的PTK7高表达率均显著高于瘤旁非肿瘤黏膜和LGD组织(P<0.05)；结肠癌组织的PTK7高表达率也显著高于HGD组织(P<0.05)。见表2，图2。

表2 不同类型组织PTK7表达情况比较[n(%)]

图2 四种不同类型组织PTK7表达情况(免疫组织化学染色，×400)

3 讨论

3.1结肠腺瘤是结肠癌的癌前病变，其主要通过结肠镜检查发现并在结肠镜下切除[7]，其发展至结肠癌过程中可出现LGD和HGD。我国早期结肠癌的诊出率仍较低，这与其早期临床症状不显著及对该病的发生机制尚不十分清楚有关，从分子水平研究癌前病变对诊断早期结肠癌具有重要意义。

3.2DOK3是调节酪氨酸激酶信号反馈回路的接头蛋白，其在免疫应答中的作用尚未完全阐明[8]。DOK3对多种肿瘤的发生起抑制作用，Berger等[9]研究发现，DOK3通过维持程序性细胞死亡配体1和上调死亡配体2在浆细胞分化中发挥重要作用，敲除DOK3的小鼠肺腺癌的风险显著增加，这也验证了DOK3是一抑癌基因，具有成为肺部肿瘤治疗靶点的潜力。崔建芳[4]研究发现，DOK3表达下降可能是胃癌变早期重要的生物学事件，其可能参与了癌前病变发展为癌变的过程，具有一定分子生物学诊断价值；且经敲降DOK3基因后，HGC-27胃癌细胞的增殖及侵袭迁移能力显著增强，考虑DOK3可能为一抑癌因子。然而，近期有研究[10]发现，DOK3的表达水平与神经胶质瘤的恶性程度呈正相关，因此，DOK3在肿瘤发生、发展中发挥的作用仍需要进一步研究。

3.3PTK7也称为结肠癌激酶4，参与了多种肿瘤的发生、发展，并在多种类型的肿瘤中呈高表达[11]。有研究[12,13]表明，PTK7高表达可促进大肠癌的进展并降低患者生存率，且PTK7的致癌作用受到miR-205-5p的调节。在Ⅰ～Ⅳ期的肝细胞癌中，PTK7的表达量增加，是降低患者总生存期的危险因素，其有望成为诊断肝细胞癌和预测患者生存预后的生物标志物[14]。另有研究[6]发现，PTK7在前列腺癌组织中高表达，且是影响前列腺癌患者生存预后的危险因素。张东海等[15]发现，在结肠腺瘤组织中，PTK7在HGD组织中的表达水平高于LGD组织，且患者与性别、年龄存在关联性。

3.4本研究发现，DOK3在HGD和结肠癌组织中主要呈低表达，其表达水平显著低于LGD和瘤旁非肿瘤黏膜组织，提示DOK3可能也是结肠癌的抑癌因子，参与了结肠癌的发生、发展。与DOK3的表达情况相反，PTK7在HGD和结肠癌组织中主要呈高表达，其表达水平显著高于LGD和瘤旁非肿瘤黏膜组织，因此推测DOK3、PTK7均参与了结肠癌前病变发展至结肠癌的过程，联合检测DOK3、PTK7可能具有结肠癌早期诊断以及预后判断的价值，也可能成为结肠癌治疗的潜在靶点。

综上所述，结肠腺瘤级别越高，DOK3表达量越低，而PTK7表达量则越高。DOK3可能作为抑癌因子，PTK7作为促癌因子参与了结肠癌的发生、发展。联合检测DOK3、PTK7具有结肠癌早期诊断及预后判断的应用价值。