miR-25与大动脉粥样硬化性脑卒中相关性研究

代英杰

北部战区总医院 神经内科，辽宁 沈阳 110016

大动脉粥样硬化性脑卒中(large artery atherosclerotic stroke，LAAS)是由于颅内外大血管的动脉粥样造成的缺血性脑卒中[1-3]。有研究表明，miRNAs作为一类非编码小分子RNA，参与诸多生命活动的调控，已成为某些疾病诊断、治疗与预后判定的分子靶点，其在动脉粥样硬化的发生发展中发挥重要作用[4-6]。miR-25与miRs-93、miRs-106b共同组成 miR-106-25基因簇[7]。有研究表明，miR-25在缺血性卒中患者外周血中表达水平出现了下调或上调[8-9]，但其在缺血性脑卒中的作用机制未见报道。本研究通过检测LAAS患者血液中miR-25的表达水平，探讨其作为该病诊断分子标志物的可能性，同时探索miR-25在LAAS形成中的分子机制。现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 将北部战区总医院2015年6—12月收治的41例发病72 h内确诊LAAS患者纳入B组。纳入标准：有急性、突发的持续24 h以上的局灶性神经功能缺失；经头颅核磁共振CT检查发现相应的阳性病灶。排除标准：伴有严重心脏疾病，近期发生心绞痛、急性心肌梗死者；严重肝肾功能不全者；两周内服用过抗凝或抗血小板药物者。另将同期于我院体检的42例健康志愿者纳入A组。本研究经医院伦理委员会批准。所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 获取血液标本 通过问卷调查、体格检查与实验室检查等，收集两组研究对象的临床资料，包括年龄、性别、体质量指数、血压、血脂、既往史等。B组患者分别于入院次日清晨与发病第10天进行采血，A组于体检当日采集外周静脉血4 ml，乙二胺四乙酸抗凝，上下颠倒混匀后立即置于4℃冰箱保存，于2 h内进行血浆分离。以1 500 r/min离心10 min，将血浆转移至1.5 ml无RNA酶离心管中，于-80℃冻存。

1.2.2 细胞培养与基因瞬时转染 人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECS)于含有10%胎牛血清的1 640培养基，以37℃条件下，5%CO2孵箱中培育。当细胞长满瓶底后，用0.25%胰酶消化，进行传代培养。转染前1 d铺6孔板，调整细胞密度为2×105～4×105个/ml。待细胞密度为60%～80%时，进行相关小RNAs、siRNA转染。小RNAs序列如下：miR-25 模拟物(miR-25 mimics)，5′-AUUGCCCAAGUCUCCGCCUUU-3′；miR-25抑制物(miR-25 inhibitor)，5′-CAAUUGCCCAAGUCUCCGCCU-3′；阴性对照(NC)，5′-UUCUCCG AACGUGUCACGUTT-3′；siCYP17A1，5′-AUGAUAACUUCUGUGCCCUdTdT-3′。将小RNAs及转染试剂jetPRIME分别混于jetPRIME缓冲物，静置10 min后滴入6孔板，置培养箱中孵育。转染后4 h，PBS漂洗，加入新鲜的培养基。48 h后收集细胞。

1.2.3 实时荧光定量聚合酶链反应检测 细胞及血液总RNA提取采用TRIzol法。使用TransScript miRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix Kit(Transgene公司)进行miRNA cDNA合成。使用PrimeScript RT Master Mix Kit(Takara公司)试剂盒将mRNA反转成cDNA。应用SYBR Green Real-time PCR试剂盒(TakaRa公司)扩增miR-25与CYP17A1 cDNA。具体操作均严格按照说明书进行。

1.2.4 细胞计数试剂盒检测 将消化转染后细胞密度调整为2×104～5×104个/ml。每孔加入100 ml细胞悬液，每组设5个复孔，37℃、5%CO2孵箱中培养。分别于24、48、72、96 h，每孔加入10 ml细胞计数试剂溶液，于培养箱内继续孵育2 h。测定A450 nm波长吸光度，以波长吸光度作为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1.2.5 克隆形成实验 将消化转染后细胞密度调整为3×104～5×104个/ml。每孔加入100 ml细胞悬液，于培养箱孵育3～4 d。以PBS溶液漂洗，10%甲醛固定20 min。苏木素染色10 min，自来水冲洗，空气干燥，计算集落形成情况。

1.2.6 流式细胞术检测细胞凋亡 消化转染后细胞浓度调整为5×105～1×106个/ml。取1 ml细胞悬液，以4℃、3 000 r/min离心10 min，弃上层清液。加入1 ml冷PBS溶液，轻震悬浮细胞。以4℃、3 000 r/min离心10 min，弃上层清液。采用100 ml binding buffer重悬细胞。收集细胞并用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(南京凯基公司)染色，流式细胞仪检测细胞早期凋亡率。

1.2.7 Transwell小室法与划痕实验检测细胞迁移能力 消化转染后的细胞，用双无培养基稀释细胞悬液，分别向Transwell上室加入100 μl含有2×105个HUVECS细胞，下室加入500 μl完全培养基，37℃培养24 h，取出小室，10%甲醛固定30 min，依次进行苏木素、伊红染色、苏木素复染，并用棉签擦净膜上表面细胞。用刀片小心剥下膜，中性树脂封片。干燥后，显微镜下观察计数。将转染后的HUVECS细胞接种6孔板中，用1 ml枪头小心在孔底划痕，PBS溶液清洗3次，加入新鲜培养基。倒置显微镜下拍照，沿划痕边缘等间距取3处测量划痕宽度，取平均值。48 h后继续拍照，在相同观察点测量划痕宽度。

2 结果

2.1 两组研究对象一般资料比较 B组收缩压、低密度脂蛋白、高血压病史比例均高于A组，差异均有统计学意义(P<0.05)。两组患者其他一般资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组研究对象一般资料比较

2.2 两组研究对象miR-25表达量比较 与治疗前比较，B组治疗后的miR-25表达量显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；治疗后，B组的miR-25表达量仍显著高于A组，差异有统计学意义(P<0.05)。相关性分析结果显示，miR-25表达水平与收缩压呈正相关(r=0.37，P<0.05)。

2.3 miR-25对HUVECS细胞生物学功能的影响 与对照组相比，miR-25 mimics或miR-25 inhibitor转染组miR-25表达水平分别显著升高或降低(P<0.05)，提示转染成功。细胞计数试剂盒检测结果显示，miR-25 mimics转染组HUVECS增殖能力较对照组显著下降，miR-25 inhibitor转染组HUVECS的增殖能力较对照组显著上升(P<0.05)。克隆形成实验结果显示，miR-25 mimics转染组HUVECS克隆形成能力较对照组显著下降，miR-25 inhibitor转染组HUVECS的克隆形成能力较对照组显著上升(P<0.05)。流式细胞术检测细胞早期凋亡结果显示，miR-25 mimics转染组较对照组HUVECS早期凋亡率显著升高，而miR-25 inhibitor转染组较对照组HUVECS早期凋亡率显著下降(P<0.05)。Transwell小室法检测结果显示，与对照组相比，miR-25 inhibitor转染组HUVECS迁移能力显著增加，而miR-25 mimics转染组HUVECS迁移能力显著降低(P<0.05)。见图1。

图1 miR-25对HUVECS细胞生物学功能的影响(a.miR-25 mimics与miR-25 inhibitor转染效率的检测；b.细胞计数试剂盒法检测miR-25对HUVECS细胞增殖能力的影响；c.克隆形成实验检测miR-25对HUVECS细胞克隆形成能力的影响；d.流式细胞术检测miR-25对HUVECS细胞早期凋亡的影响；e.Transwell小室法检测miR-25对HUVECS细胞迁移能力的影响)

3 讨论

动脉粥样硬化受到环境因素与遗传因素共同影响[10]，作为一种动脉粥样硬化相关疾病，可推测LAAS发病为多因素共同参与。近年来，诸多miRNA被报道参与动脉粥样硬化的发生[11-13]。有研究表明，miR-25的靶基因参与细胞增生、分化、迁移、凋亡炎症、应激等多种生物活动的调节，在急性心肌梗死的发生中发挥重要作用[14]。

本研究通过检测LAAS患者中miR-25的表达量发现：治疗后，B组miR-25表达量显著低于治疗前，差异有统计学意义(P<0.05)；治疗后，B组miR-25表达量显著低于A组，差异有统计学意义(P<0.05)。临床治疗可以降低LAAS患者的miR-25水平，miR-25参与LAAS的发生、发展，可能为LAAS治疗的潜在生物标志物。尽管miR-25与高血压间的关系尚未被报道，但本研究发现，高miR-25水平与收缩压有关。miR-25可能在高血压源性LAAS发病中起到重要作用。本研究结果还发现，miR-25抑制HUVECS的增殖和迁移，并促进其凋亡。但miR-25是如何对血管内皮细胞发挥作用的，尚需要进一步阐明。可通过生物信息学软件对miR-25的靶基因进行预测、筛查与鉴定，并结合生物学功能研究，进一步明确miR-25在LAAS中相关信号转导通路。

综上所述，miR-25可调控HUVECS增殖、迁移及早期凋亡，可能为LAAS治疗的潜在靶点。