细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子3在宫颈癌中表达及临床意义

郑 乐

中国医科大学肿瘤医院(辽宁省肿瘤医院) 妇科，辽宁 沈阳 110042

宫颈癌位于女性多发恶性肿瘤第二位[1]，且预后差，主要与其发生侵袭转移相关。寻找宫颈癌早期诊断、预测病情严重程度的标志物及宫颈癌的治疗靶点至关重要。周期素依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent kinases，CDKs)的负调节蛋白激酶抑制剂(cyclin-dependent kinase inhibitors，CKIs)，通过与CDKs或CDK-cyclin复合物相互结合，从而抑制CDKs活性，调节细胞周期正常有序地进行[2-3]。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子3(cyclin-dependent kinase inhibitor 3，CDKN3)属于CKIs中的一类，是细胞周期调控网络中的重要一环[4]。CNKN3在正常的细胞周期中主要作为CDK2的抑制因子，在G1～S期与CDK2稳定结合，从而参与调节细胞周期[5]。CDKN3在多种恶性肿瘤中表达异常，如乳腺癌、前列腺癌、肝癌、肾癌、食管癌等，其表达水平常与肿瘤的发生发展相关[6-10]。本研究旨在探讨CDKN3在宫颈癌中的表达及临床意义。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源 收集自2015年1月至2016年1月于中国医科大学肿瘤医院妇科行手术治疗且经病理检查确诊患者的60例宫颈癌组织、30例宫颈原位癌组织、30例正常宫颈组织。60例宫颈癌组织中，患者中位年龄48岁；临床分期Ⅰ～Ⅱa期32例，Ⅱb～Ⅳ期28例。20例宫颈癌和配对癌旁宫颈组织标本取自于手术切除30 min内组织标本。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 主要试剂 浓缩型兔抗人CDKN3多克隆抗体(北京博奥森)；SP试剂盒及DAB显色剂(北京中杉金桥)；SDS—PAGE凝胶配制试剂盒(南京凯基生物)。

1.3 研究方法 (1)免疫组织化学法。按试剂盒说明进行(工作浓度为1∶200)。以PBS代替一抗作为阴性对照，以CDKN3阳性染色切片作为阳性对照。(2)蛋白免疫印迹法。对20例早期宫颈癌及配对癌旁组织进行检测。提取组织中核蛋白，测定蛋白质含量，电泳，转膜，封闭，加入一抗，缓冲液稀释(1∶1 000)，孵育聚偏氟乙烯膜，4℃过夜，缓冲液洗3次，每次10 min，将二抗用缓冲液稀释(1∶2 000)，室温振荡孵育1 h，缓冲液洗3次，每次10 min，用ECL发光法试剂盒显色，凝胶成像系统分析条带灰度值。

1.4 统计学方法 采用SPSS 22.0统计学软件对数据进行分析。计数资料以例(百分率)表示，组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组织化学法检测结果 免疫组织化学法结果显示，CDKN3阳性表达主要定位于细胞核内，在宫颈癌组织、宫颈原位癌组织、正常宫颈组织中的阳性表达率分别为81.67%(49/60)、60.00%(18/30)、20.00%(6/30)。宫颈癌组织中CDKN3的阳性表达率明显高于宫颈原位癌组织及正常宫颈组织；宫颈原位癌组织CDKN3的阳性表达率明显高于正常宫颈组织，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 免疫组织化学法检测结果(a.CDKN3在宫颈癌组织中的表达；b.CDKN3在宫颈原位癌组织中的表达；c.CDKN3在正常宫颈组织中的表达；SP×400)

2.2蛋白免疫印迹法检测结果 蛋白免疫印迹法结果显示，CDKN3蛋白在宫颈癌组织中的表达水平高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图2 蛋白免疫印迹法检测结果

2.3 CDKN3在宫颈癌中的表达与宫颈癌临床病理因素之间的关系 CDKN3在宫颈癌中的表达与临床分期相关(P<0.05)，与年龄、病理类型无关(P>0.05)。见表1。

表1 CDKN3在宫颈癌中的表达与宫颈癌临床病理因素之间的关系/例(百分率/%)

3 讨论

细胞周期调控异常在肿瘤细胞增殖中起重要作用，与肿瘤进展密切相关。CDKN3选择性与CDK2结合，降低CDK2使抑癌基因视网膜细胞瘤蛋白(Rb蛋白)磷酸化的能力[11]，去磷酸化的Rb蛋白与转录因子E2F1结合，抑制产生细胞周期相由G1/S的转变所需的蛋白，从而抑制G1相至S相的转变[12-14]，可以表现抑癌基因的作用。同时，CDKN3也是一种Mdm2结合蛋白，可以与Mdm2和p53形成复合体，降低p21的敏感度，减少p53靶基因产物的生成，从而促进肿瘤细胞周期的进展[15]。

本研究结果显示，宫颈癌组织中CDKN3呈高表达，正常宫颈组织中CDKN3呈低表达；正常宫颈组织及宫颈原位癌组织中CDKN3的表达水平比较，差异有统计学意义，可能由于此基因是在宫颈肿瘤组织中早期出现的上调基因；CDKN3与宫颈癌的临床分期相关，提示CDKN3可能在宫颈癌的发生发展过程中起到了重要作用。Lai等[9]对58例肾细胞癌手术切除组织进行免疫组织化学法分析发现，CDKN3蛋白高表达并存在胞浆表达，临床病理分析表明，其与较高的组织学分级有关。Xing等[16]在肝癌细胞系和临床样本中检测到CDKN3高表达，进一步分析肝癌病例的临床病理资料发现，CDKN3高表达与肿瘤分期晚和分化程度差相关。Niculescu等[17]在缺乏胆碱的神经母细胞瘤细胞系IMR-32中检测到CDKN3表达增加，CDKN3高表达的分子机制可能与CDKN3基因启动子区域的低甲基化有关。Yu等[18]通过对11例卵巢浆液性腺癌和9例卵巢子宫内膜样腺癌组织进行基因甲基化筛查发现，CDKN3基因甲基化与对照组的正常输卵管和子宫内膜组织比较明显降低。

综上所述，CDKN3与宫颈癌的发生发展密切相关，考虑可将其作为诊断宫颈癌及判断预后的有效生物指标，但其具体作用机制尚待进一步研究。