原发性干燥综合征患者泪液及唾液中细胞因子水平变化研究

陈 晔，王文婷，詹 峰

1.常州市肿瘤医院 检验科，江苏 常州 213003；2.联勤保障部队第九〇四医院常州院区 神经内科，江苏 常州 213003

原发性干燥综合征是一种以女性多发的全身性风湿性和自身免疫性疾病，其特征是多个部位的外分泌腺淋巴细胞浸润，特别是唾液腺和泪腺[1]。临床上，干燥综合征可影响多个器官及系统，包括皮肤、呼吸道、泌尿生殖道和胃肠道中的外分泌腺，以及胰腺外器官受累[2]。当淋巴细胞浸润累及泪腺和唾液腺，可造成泪液和唾液分泌质量改变、减少，最终导致干眼症和口腔干燥症。目前，原发性干燥综合征导致的干眼症和口腔干燥症发病机制仍未完全明确。此外，用于测定眼部和口腔体征的临床工具通常易受主观影响，且取决于医师的临床经验。而细胞因子分析检测的优点是不易产生主观偏倚[3]。原发性干燥综合征的组织学特征为单核细胞向外分泌腺的浸润，CD4+T细胞、B细胞亚群、树突细胞、巨噬细胞通过引发炎症反应导致功能障碍并最终破坏外分泌腺[4]。尽管已有研究报道原发性干燥综合征患者的细胞因子表达水平[5]，但未同时比较来自同一个体的泪液及唾液中的细胞因子水平。本研究分析同一队列原发性干燥综合征患者泪液及唾液中的细胞因子谱，旨在探讨原发性干燥综合征患者泪液及唾液中的细胞因子水平。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取自2015年6月至2019年6月于常州市肿瘤医院就诊的45例原发性干燥综合征患者为研究对象，并将其纳入B组。纳入标准：符合原发性干燥综合征国际分类标准[6]；女性。选取同期健康体检者55例纳入A组，均为女性，平均年龄(56.7±10.6)岁。B组患者平均年龄(51.0±13.8)岁。两组研究对象年龄构成比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比行。本研究经医院伦理委员会批准。所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 Schirmer试纸试验 将Schirmer泪液试纸圆弧端夹于受试者眼睑外三分之一处结膜囊内，另一端悬挂于眼外，5 min后取下试纸，测量被泪液湿润的长度并记录，然后将试纸转移至磷酸盐缓冲液中，-80℃贮存。

1.2.2 静态全唾液流率检测 收集未刺激的全唾液以确定唾液分泌速率。采集唾液前，让受试者以清水漱口，去除口腔内食物残渣，然后向无菌eppendorf管内持续吐唾液，保持5 min。样本以4℃、5 000 r/min离心20 min，取上清，将其等分，-80℃储存。

1.2.3 泪液及唾液细胞因子水平分析 将储存在磷酸盐缓冲液中带有Schirmer条带的eppendorf管在冰上解冻，涡旋，并将105 μl样品转移到新管中。将唾液样品以4℃、5 000 r/min离心5 min，将105 μl上清液转移至新管中。然后以12 000 r/min、4℃离心10 min。部分上清液用于蛋白质测量，并将等体积的磷酸盐缓冲液/1.0%牛血清白蛋白加入剩余的样品中。吸取所得磷酸盐缓冲液/0.5%牛血清白蛋白悬浮液25 μl加入广谱筛选试剂盒(Bio-Plex Pro Human Cytokine 27-plex Assay，货号M50-0KCAF0Y)板上，检测白细胞介素(interleukin，IL)-2、IL-4、IL-8、IL-17A、γ干扰素(interferon-γ，IFN-γ)、巨噬细胞炎症蛋白1b(macrophage inflammatory protein 1b，MIP-1b)、干扰素诱导蛋白10(interferon-inducible protein 10，IP-10)和巨噬细胞炎症蛋白1a(macrophage inflammatory protein 1a，MIP-1a)等细胞因子。使用蛋白定量试剂盒(Pierce BCA Protein Assay Kit，Thermo Scientific)估算Schirmer条带悬浮液和唾液中的总蛋白质浓度。

2 结果

2.1 两组研究对象临床干眼评估及口腔检查结果比较 A组Schirmer试验湿润长度为(21.0±6.7)mm，长于B组的(4.2±1.9)mm，两组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。A组静态全唾液流率为(2.8±0.4)ml/min，高于B组的(0.9±0.3)ml/min，两组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 两组研究对象泪液及唾液中细胞因子水平比较 B组泪液IL-2、IL-4、IL-8、IL-17A、IFN-γ、MIP-1b、IP-10水平均显著高于A组，两组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。B组唾液IP-10、MIP-1a水平均显著高于A组，两组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 两组研究对象泪液及唾液中细胞因子水平比较(a.泪液中细胞因子水平；b.唾液中细胞因子水平)

2.3 Schirmer试验湿润长度、静态全唾液流率与细胞因子水平相关性分析 Schirmer试验湿润长度与泪液中IL-2、IL-4、IL-8、IL-17A、IFN-γ、MIP-1b水平呈负相关(r=-0.434、-0.528、-0.492、-0.463、-0.663、-0.604，P<0.05)。静态全唾液流率与唾液中IP-10、MIP-1a水平呈负相关(r=-0.289、-0.289，P<0.05)。

3 讨论

在唾液和泪液中发现分子及免疫生物标志物有利于干燥综合征患者的疾病诊断，并帮助建立靶向治疗[7]。干眼症是多因素造成的眼表面疾病，与眼表炎症和损伤有关，特征为泪膜体内平衡丧失[8]。本研究中，与A组比较，B组患者泪液中Th1型细胞因子IL-2、IFN-γ，以及Th2型细胞因子IL-4水平均升高。既往研究表明，干燥综合征患者常并发干眼症，在眼结膜组织中可发现大量活化的CD4+T辅助细胞，提示T细胞归巢进一步促进了结膜中的免疫激活[9]。此外，这些活化的CD4+T辅助细胞在眼结膜组织中分泌促炎细胞因子可能通过Th1和Th2介导的免疫反应造成眼表损伤。IFN-γ可由天然杀伤细胞、单核细胞、巨噬细胞分泌。有研究报道，IFN-γ水平升高与干燥综合征相关，可与上皮组织相互作用产生炎症反应[10-12]，还可以通过激活外源性凋亡在角膜上皮细胞凋亡和组织破坏中发挥重要作用[13]。IL-12主要由巨噬细胞和树突细胞产生，在调节IFN-γ产生和促进Th1应答中起重要作用。

本研究中，上调的IL-4主要参与Th2介导的免疫应答和B细胞的活化，这些细胞因子在固有和适应性免疫中起关键作用，并提示患者疾病进展。 本研究中，B组患者泪液中MIP-1b和IL-8水平显著升高。MIP-1b和IL-8可以吸引Th1细胞、天然杀伤细胞、巨噬细胞表达特定受体(如CCR5和CXCR3)的树突细胞到角膜和结膜组织[14]。有研究表明，干眼症患者泪液中MIP-1b水平显着增加[15]。此外，IL-8对T细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞具有趋化作用。因此，T淋巴细胞的这种大量浸润和活化可能通过细胞毒性和细胞凋亡导致泪腺和眼表组织损伤。

本研究中，B组患者唾液IP-10、MIP-1a水平升高，且与静态全唾液流率相关。原发性干燥综合征对牙周疾病有负面影响[16]，IP-10参与了干燥综合征患者唾液腺中T细胞浸润的累积[17]，牙周病患者唾液中MIP-1a水平更高[18]。本研究中，B组患者泪液中抗炎细胞因子IL-17水平增加。有研究在干燥综合征患者的唾液腺和血清中检测到IL-17，证实其与干燥综合征的发病机制相关[19]。此外，IL-17还可能在干眼病的角膜上皮屏障破坏中发挥作用。

综上所述，原发性干燥综合征患者泪液及唾液中细胞因子水平显著升高，且与泪液生成减少、唾液流率减缓显著相关，从而参与影响眼干、口干的临床症状。