带状采伐对毛竹林土壤细菌群落结构及多样性的影响

王树梅，王 波，范少辉，肖 箫，夏 雯，官凤英*

(1.国际竹藤中心，竹藤科学与技术重点实验室，北京 100102；2.江苏省宜兴市林场，江苏 宜兴 214200)

毛竹(Phyllostachysedulis)是我国重要的森林资源，毛竹林面积达467.78万hm2，占全国竹林面积的72.96%[1]。毛竹林合理的采伐经营对提高竹林生产力、增加农户收入、改善生态环境具有重要意义[2]。传统的竹林经营以择伐为主，随着劳动力成本和时间成本的不断增加，人工择伐已经不能满足竹林培育及竹产业发展的需要[3]，而竹林带状采伐因省时省力，可实现竹林规模化、集约化、机械化经营，逐渐引起国内外学者的注意。但目前针对毛竹林带状采伐研究还处于初始阶段[4]，且集中在采伐后地面成竹质量[5]及土壤养分[6]等方面，对毛竹林带状采伐后土壤微生物群落结构及多样性变化、土壤菌群的功能响应研究的报道较少。

土壤微生物是土壤生态系统中的重要组成部分，在土壤有机质分解[7]、腐殖质形成[8]、土壤养分的转化等方面发挥重要作用[9]。土壤微生物及其所参与的各种生理生化过程,是实现土壤养分循环、提高土壤肥力的重要环节[10]。土壤微生物对林地环境的变化十分敏感，地上植被和土壤生态过程的变化均会导致微生物群落结构发生改变[11-12]。尤其采伐形成大小不一的林窗，使林内光照、降水、温度等发生变化，对土壤中微生物量及菌种类型等产生显著影响[13-15]。已有研究表明林窗大小影响着马尾松(Pinusmassoniana)林下凋落物中微生物群落结构和细菌多样性，某些菌纲只出现在特定大小的林窗中[16]。辽东栎(Quercuswutaishansea)林皆伐后土壤微生物群落结构在演替恢复过程中多样性逐渐降低[17]。但毛竹林地下根系明显区别于其他普通乔木，其强大的鞭根系统在土壤中形成了密集的网络结构，更加有利于土壤微生物进行各种生理生化活动，因此，研究毛竹林带状采伐后土壤细菌群落结构与土壤养分的关系及细菌群落的变化规律，对认识毛竹林带状采伐对土壤生态系统的影响及优化毛竹带状采伐经营技术具有重要的意义。

本研究通过对江苏省宜兴市林场毛竹林进行不同带宽的全竹采伐，以自然样地为对照，通过比较不同采伐宽度条带内土壤细菌群落结构与养分的差异，研究土壤微生物对不同采伐宽度干扰的响应，了解带状采伐对毛竹林土壤微生物生态恢复的影响，为毛竹林带状采伐经营模式下竹林恢复提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究地概况

试验地位于江苏省宜兴市国有林场(119°41′～119°44′E,31°13′～31°15′N)，属亚热带季风气候，年平均气温16.7 ℃，年总降水量为1 805.4 mm，年日照时间1 807.5 h，全年蒸发量886.8 mm。地形以平原、丘陵为主，是江苏省竹林资源最丰富的地区。

1.2 样地设置及样品采集

2019年12月，选取集中连片的毛竹纯林，立竹度为3 500株/hm2左右，设置采伐宽度分别为3、9、15 m，长度皆为20 m的毛竹林样方进行皆伐，各伐带分别记为A3、A9、A15。伐带之间设置等宽的缓冲带，以20 m × 20 m的毛竹林作为对照样地(CK)，每个处理均3次重复，共计12块样地。

样地采伐25 d后，采用S型多点混合取样法，利用土钻采集每一样方内0～50 cm深度的土壤，混合均匀后过2 mm筛，除去石子等大颗粒，一部分带回实验室风干、磨碎，再次过筛，用于土壤有机质的测定过0.25 mm筛，用于全氮、全磷、全钾测定的土壤过0.15 mm筛，用于碱解氮、有效磷、速效钾测定的土壤过1 mm筛。另一部分土样装于无菌离心管内，保存在-80 ℃冰箱，用于土壤微生物测序。

1.3 土壤指标测定

1.3.1 土壤养分的测定

土壤有机质采用重铬酸钾氧化-外加热法测定；全氮采用凯氏定氮法测定；全磷采用氢氧化钠熔融-钼锑抗比色法测定；全钾采用氢氧化钠熔融-原子吸收分光光度法测定；碱解氮采用碱解扩散法测定；有效磷采用盐酸-氟化铵提取-钼锑抗比色法测定；速效钾采用乙酸铵提取-原子吸收分光光度法测定[18]。

1.3.2 土壤微生物的测定

委托上海派森诺生物公司进行土壤微生物的测定。使用Omega Soil DNA Kit试剂盒(Omega生物技术公司，美国)提取土壤样品中的总DNA，采用Nanodrop 2000(赛默飞世尔科技公司，美国)对DNA浓度进行测定，并通过1.2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量。添加样本特异性Barcode序列，测序上游引物为338F-5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′，下游引物为806R-5′-CGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′，采用全式金公司的Pfu高保真DNA聚合酶对16S rRNA特定基因片段V3-V4区进行PCR扩增，对扩增产物磁珠纯化回收后进行荧光定量。荧光试剂为Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit (赛默飞世尔科技公司，美国)，定量仪器为Microplate reader(BioTek，FLx800)。根据荧光定量结果，将各样本等量混合，采用Illumina TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit(Illumina公司，美国)制备测序文库，通过2%琼脂糖凝胶电泳，选择及纯化目标片段，进行高通量测序。

按照QIIME 2 dada 2分析流程进行序列去噪或ASV(amplicon sequence variants)聚类。根据ASV在不同样本中的分布，评估每个样本的Alpha多样性水平。计算各样本的距离矩阵，衡量不同处理间的Beta多样性。根据16S rRNA测序结果，预测样本的菌群代谢功能，找出差异通路。

1.4 数据处理

使用IBM SPSS Statistics 21.0 软件进行方差分析(ANOVA)、Duncan分析及相关性分析，使用Microsoft Excel、Canoco 4.5进行绘图。

2 结果与分析

2.1 不同伐带间土壤养分分析

带状采伐对毛竹林土壤中的有机质、全氮、全磷、碱解氮、速效钾含量造成显著影响(P<0.05)，全钾及有效磷含量有影响但不显著(P>0.05)。对不同宽度的伐带间进行两两比较发现(表1)，伐带间土壤中各养分含量除碱解氮和全磷外均表现出A3>A9>A15，同CK相比，3 m宽度伐带的土壤有机质、碱解氮含量显著增加(P<0.05)，速效钾含量显著降低(P<0.05)，其他养分差异不显著。15 m采伐宽度其有机质、碱解氮、全氮及速效钾含量均显著低于对照样地(P<0.05)，全磷含量显著升高(P<0.05)。随着采伐宽度的增加，土壤有效磷、全钾、速效钾含量减小，土壤有机质、全氮逐渐减小，碱解氮先增后降，可见适当采伐可以提高土壤肥力，但采伐宽度超过一定限度后，土壤肥力降低，速效养分含量减少。

表1 不同伐带间土壤养分含量Table 1 Soil nutrient contents in different cutting strips

2.2 不同伐带间土壤细菌ASV分析

对3种伐带宽度样地与对照进行韦恩图分析(图1)，共得到个73 282个ASV，其中A3、A9、A15、CK各样地分别包含18 631、18 020、17 979、18 652个ASV，CK样地特有的ASV为11 415个，占总数量的21.33%，而A3、A9、A15样地中特有的ASV及所占比例分别为10 127(18.93%)、9 155(17.11%)、10 755(20.10%)个，它们共同包含的ASV数量为2 359(4.41%)个。不同宽度采伐样地间土壤ASV数量由大到小为CK、A3、A9、A15，说明毛竹林地进行带状采伐减少了土壤中细菌类群的数量，且伐带宽度越大，其土壤中细菌类群数量越少。

图1 不同伐带间细菌ASV数量的韦恩图Fig.1 Venn diagram of ASV number of bacteria in different cutting strips

2.3 不同伐带间土壤细菌多样性分析

丰度等级曲线(rank abundance curve)可以直观地反映群落中高丰度和稀有ASV的数量。横坐标为按丰度大小排列的ASV的序号；纵坐标为每个ASV在该处理中的丰度(均值)的对数值；每条折线代表1个处理，折线在横轴上的长度反映了该处理在该丰度中的ASV数。折线的平缓程度，反映了群落组成的均匀度，折线越平缓，则群落中各ASV间的丰度差异越小，群落组成的均匀度越高；折线越陡峭，则均匀度越低。通过细菌群落丰度等级曲线可知(图2)，A3采伐样地折线在横轴上跨度最大，并且折线比其他处理平缓，说明3 m采伐宽度的毛竹林地相较于其他样地土壤细菌群落丰富度更高，且物种分布更均匀。但随着采伐宽度的增大，其毛竹林地内的细菌群落丰富度和物种均匀度均降低。

图2 不同伐带间细菌群落丰度等级曲线Fig.2 Rank abundance curve of bacterial communities under different cutting strips

对于环境梯度处理引起的微生物群落差异，主要是微生物丰度的消长变化，此时可以采用加权的距离计算方法，PCoA(principal co-ordinates analysis)最大限度地保留了原始样本的距离关系，将样本距离矩阵经过投影后，在低维度空间进行展开，两点在坐标轴上的投影距离越近，表明这两个样本在相应维度中的群落组成越相似。通过对不同伐带间细菌群落进行PCoA分析(图3)，发现带状采伐处理的毛竹林地与对照样地投影距离未有重合部分，说明群落间相似性较小，带状采伐对毛竹林地群落组成具有影响，其中A15采伐样地与对照样地投影距离最远，差异最大，其次为A9、A3，说明带状采伐的宽度也是影响毛竹林地土壤群落组成的重要因素。A9与A15样地间投影重合，说明两个采伐样地间群落具有相似性，也说明了当采伐宽度超过一定距离时，群落间的物种组成变化差异减小。

图3 不同伐带间细菌群落PCoA分析Fig.3 PCoA analyses results of bacterial communities under different cutting strips

2.4 不同伐带间土壤细菌群落差异分析

根据ASV的结果得到各处理在各分类水平上的物种组成，选择门分类水平进行群落结构分析。如表2所示，在门分类水平上共计检测到36个已知菌门及未确定种，其中优势菌门分别为变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、绿湾菌门(Chloroflexi)，4种优势菌门物种数在不同样地中占比为85%～90%。分析可知各处理A3、A9、A15分别有31、30、30个菌门，对照样地有33个菌门，4个样地所含菌门数大小顺序为CK>A3>A9=A15，说明带状采伐对样地内细菌门类具有影响，采伐宽度越大，菌门类数量越小。

表2 不同伐带间土壤细菌在门水平上的细菌种类组成Table 2 Soil bacteria community relative abundances of Phylum under different cutting strips

带状采伐后占据最大优势的菌门是变形菌门(38.40%)，其次是放线菌门(31.04%)，再次是酸杆菌门(12.68%)，而其他门类所占比例非常低。对照样地中占优势的菌门依次为变形菌门(32.39%)、放线菌门(30.55%)、酸杆菌门(17.50%)、绿湾菌门(6.56%)、疣微菌门(Verrucomicrobia)(4.08%)、浮霉菌门(Planctomycetes)(2.39%)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)(2.06%)和其他占比非常低的门类。同对照样地相比，A3样地酸杆菌门、芽单胞菌门显著减少(P<0.05)，绿湾菌门、疣微菌门、浮霉菌门、Patescibacteria菌门有所减少，变形菌门、放线菌门、匿杆菌门(Latescibacteria)、Rokubacteri菌门有所增加，但差异不显著(P>0.05)。而A9样地变形菌门相对丰度最大，显著高于对照样地(P<0.05)，比CK提高了10.15%，Patescibacteria菌门、Rokubacteri菌门增加，而其他菌门相对丰度有所减少，其中酸杆菌门、芽单胞菌门显著减少(P<0.05)。A15样地Rokubacteri菌门、变形菌门、Patescibacteria菌门相对丰度显著高于对照样地(P<0.05)，疣微菌门、浮霉菌门、匿杆菌门有所增加，但差异不显著(P>0.05)，酸杆菌门和芽单胞菌门丰度显著低于对照样地(P<0.05)，15 m伐带宽度中细菌丰度最小，比CK降低了4.90%，放线菌门、绿湾菌门有所减少。

2.5 优势细菌群落丰度与土壤养分的相关性分析

4种优势菌门与土壤养分相关性分析结果表明(表3)，变形菌门与全氮(R=-0.644，P<0.05)、有效磷(R=-0.811，P<0.01)及速效钾(R=-0.658，P<0.05)呈显著负相关；放线菌门与土壤有机质(R=0.684，P<0.05)、全氮(R=0.621，P<0.05)、有效磷(R=0.721，P<0.01)呈显著正相关；酸杆菌门与速效钾呈(R=0.684，P<0.05)显著正相关，全磷、碱解氮、全钾对优势菌群影响不显著。

表3 优势细菌群落丰度与土壤养分含量的相关性分析Table 3 Correlation analysis between soil nutrients content and soil bacterial community

2.6 不同伐带间土壤细菌功能潜能分析

通过PICRUSt 2软件推断处理样本内已知微生物的基因功能谱，使用MinPath预测代谢通路，得到KEGG功能通路丰度图(图4)。KEGG数据库将生物代谢通路归为6大类，包括代谢(metabolism)、遗传信息处理(genetic information processing)、环境信息处理(environmental information processing)、细胞进程(cellular processes)、生物体系统(organismal systems)和人类疾病(human diseases)。如图4所示，KEGG第1等级功能差异极显著(P<0.01)，其中丰度最大的是代谢通路，这是带状采伐样地土壤细菌的优势功能，其次为遗传信息处理、细胞进程、环境信息处理通路。生物体系统和人类疾病通路里功能基因丰度较小，因此这两个通路不是采伐后土壤细菌的主要功能。在第2等级上，代谢通路中含有11种2级通路，他们的功能基因丰度大小顺序为碳水化合物代谢>氨基酸代谢>辅酶和维生素代谢>萜类化合物和聚酮化合物代谢>异生素降解和代谢>脂质代谢>其他氨基酸代谢>能量代谢>其他次生代谢物生物合成>多糖的生物合成与代谢>核苷酸代谢；遗传信息处理通路包含4种2级通路，依次为DNA复制修复>折叠、分类和降解>翻译>转录；细胞进程通路中2级通路功能基因丰度大小顺序为细胞运动>细胞生长与死亡>运输和分解代谢>细胞群落-原核生物；环境信息处理通路依次为膜运输>信号转导>信号分子相互作用。

图4 KEGG功能通路丰度图Fig.4 Abundance diagram of KEGG functional pathway

3 讨 论

毛竹林实施带状采伐后林内形成林窗，能够对竹林生态系统产生影响，研究表明中小尺度的林窗可以促进竹林养分循环和森林功能的提升[19-20]。毛竹林带状采伐后所形成的林窗对土壤养分和土壤细菌类群产生显著影响，带状采伐后土壤有机质、全氮、碱解氮、速效钾含量波动较大，而全磷、有效磷及全钾含量变化较小；土壤中的有机质主要来自凋落物及根系死亡后的分解，土壤氮素主要来自生物固氮，而磷、钾元素多来自矿质分解，土壤中有机质及速效养分的生成离不开土壤微生物的作用。带状采伐后林窗内温度、湿度、风力等微环境因子改变[21]，促进了土壤微生物活动，加速了林窗土壤中的养分循环。本研究发现随着采伐宽度的增大，林地土壤中有机质和速效养分含量降低，全氮、全钾长效养分降低，全磷含量略有增加，其中3 m宽伐带内土壤有机质与碱解氮含量显著高于对照样地，说明适度采伐形成的林窗使得土壤有机质与碱解氮含量增加，当采伐宽度过大，超出了竹林生态系统自我调控能力，造成竹林生态系统失衡，导致林内土壤中有效磷、速效钾、全钾的含量下降。这与韩文娟等[22]对黄龙山油松(P.tabuliformis)人工林，刘聪等[23]对辽东次生林，欧江等[24]对长江上游马尾松林不同大小林窗内土壤养分及理化性质变化特征的研究结论相同。对不同伐带间土壤微生物群落结构及多样性研究发现，3 m采伐样地内土壤细菌群落丰度最高，物种分布更加均匀，有利于土壤中有机质及氮素的分解，说明适度采伐后土壤养分提高是因为采伐后土壤内微生物群落维持着高丰度及高均匀度。随着采伐宽度的增加，毛竹林林窗增大，土壤中细菌类群的数量、群落丰富度、物种均匀度都降低，从而也造成伐带间土壤中有机质、全氮、有效磷、全钾和速效钾含量的减少。

Alpha多样性和Beta多样性研究发现采伐造成毛竹林地内细菌群落组成数量的差异，表现出CK >A3 >A9 >A15的趋势。3 m采伐宽度提高了土壤细菌群落丰富度，但当采伐宽度超过一定距离时，群落间微生物物种组成的差异减小，9、15 m采伐宽度的细菌群落间具有相似性，且细菌群落丰富度降低，物种均匀度降低。有研究发现土壤细菌群落的多样性受到地表植物分布的影响[25]，并且未采伐的竹林地拥有稳定的生态系统，能促进土壤微生物的繁殖[26]，毛竹的均匀分布使土壤中细菌群落保持良好的结构性[27]，但毛竹林地单一的树种构成也造成土壤细菌组成的单一性[28]。此外，土壤细菌的均匀度及多样性不仅受到地表植被、土壤环境等因素的影响，还受到地下根系及凋落物的次级代谢分泌物等的影响[29]。毛竹的生物学特性与乔木有着明显区别，其地下鞭根系统既是繁殖器官又是营养器官，可形成强大的网络结构，通过无性繁殖可以快速实现竹林的扩张。当地面毛竹被采伐后，地下鞭根依旧接受相邻毛竹的营养供给，保持鞭根活性。但毛竹单鞭年生长一般为2 m，最大年生长量可到达5 m[30]，采伐宽度过大，鞭根的生长无法达到采伐样地宽度，因此3 m采伐宽度带因其地下致密的鞭根网络结构与林窗微环境的促进作用，使土壤微生物群落组成的丰富度和多样性维持较高水平。同样9～15 m的采伐样地其采伐宽度过宽，造成土壤微生物物种组成降低。同时本研究发现在竹林生态系统中，由于树种单一，环境因素的改变对毛竹林地土壤细菌群落结构多样性的影响大于地表植被对土壤细菌的影响。

带状采伐提高了优势菌门的丰度，同时部分菌门因采伐的干扰导致丰度降低。带状采伐和对照样地中占据优势的菌门有变形菌门、放线菌门，酸杆菌门、绿湾菌门，4种优势菌门占比达到85%～90%。变形菌门属革兰阴性菌，α-变形菌纲中包括许多与碳、氮固定相关的细菌，γ-变形菌纲中的细菌可以溶解土壤中难溶性磷酸盐，有研究认为变形菌门的丰度越大，土壤中有机质和C、N养分含量越多，但本研究发现带状采伐后毛竹林地土壤中的变形菌门与全氮、有效磷及速效钾呈显著负相关，这与前人研究结果有所不同[31]，可能是由于竹种类型及土壤生境的差异所造成的。放线菌门属革兰氏阳性菌，可以降解土壤中的各种不溶性有机物质，特别是分解凋落物及植物残体中纤维素和木质素[32]。本研究发现带状采伐后放线菌门与有机质、全氮和有效磷呈显著正相关(P<0.05)，这与Juhnke等[33]的研究结论相似。同时也说明带状采伐毛竹林的土壤碳、氮固定过程中放线菌门比变形菌门发挥更大的作用。酸杆菌门作为最新分出的一门细菌，可以在特殊的环境中生存[34]，并且能改变土壤的酸性条件，研究发现带状采伐后酸杆菌门相对丰度的降低阻碍了伐带内土壤速效钾的转化，分析认为由于酸杆菌门的减少，改变了竹林酸性的土壤条件，打破了原有土壤生态系统的稳定，阻碍了速效钾的释放。带状采伐后绿湾菌门的减少可能是由于采伐形成的林窗对光照等的影响造成[35]。对优势菌门与土壤养分进行相关性分析发现，有机质、全氮、有效磷、速效钾对优势菌群影响较大，说明土壤微生物与土壤养分联系紧密，良好的土壤环境为微生物群落结构的繁殖和生长提供保障，而活跃的微生物促进了土壤养分含量提高。

土壤微生物的群落结构受到生境内土壤环境特性、植被群落特征、植被根系等外界因素及自身遗传物质的内在因素共同影响。对毛竹林带状采伐后土壤细菌潜在功能进行预测发现，代谢通路所涉及的土壤细菌群落丰度最大，其中最重要的2级通路是碳水化合物代谢和氨基酸代谢，说明带状采伐后土壤细菌的优势功能主要集中在C、N两种元素的分解转化。伐带间土壤养分中有机质及全氮显著变化以及放线菌门、变形菌门数量的变化也预示着带状采伐后土壤细菌功能的变化。

本研究仅针对毛竹林带状采伐后当年微生物群落结构及多样性的变化特征，微生物群落结构和多样性会随着竹林演替过程的推进而发生变化，因此加强带状采伐后微生物群落结构的时空变化特征研究，能更好地揭示土壤微生物群落结构及多样性对带状采伐经营模式的响应。