‘凤丹’和紫斑牡丹6个产地种子脂肪酸组分的比较

张姗姗 赵 凡 魏小豹 张秀新 曾秀丽

(西藏自治区农牧科学院蔬菜研究所1，拉萨 850032) (宁波大学海洋学院2，宁波 315211) (中国农业科学院蔬菜花卉研究所3，北京 100081)

伴随经济发展和人民生活水平的提高，绿色健康具有保健功能的食品越来越受到人们推崇。2011年中国卫生部发布了《关于批准元宝枫籽油和牡丹籽油作为新资源食品的公告》，牡丹籽油因富含亚油酸和亚麻酸[1]，迅速受到关注。亚油酸和亚麻酸是人体所必需但不能自身合成的营养元素[2，3]，亚油酸有助于降低血清胆固醇水平、抑制动脉血栓的形成、降低血压、抑制癌症发生、预防老年痴呆[4-6]，亚麻酸也被称为“脑黄金原料”，在人体内可以转化为EPA和DHA[7]，具有提高婴幼儿智力、保护视力、提高免疫力的作用[8-10]。植物油脂中脂质主要是甘油三酯，但甘油三酯的沸点比较高，不容易气化及分离，并且甘油三酯的类型太多，不容易辨别，甲酯化之后每种脂肪酸甲酯都成为单独的组分，再利用GC-MS可以较为容易且准确地测定每种脂肪酸甲酯的种类和含量。

牡丹具有分布范围广、耐贫瘠、耐粗放管理、寿命长等特点[11，12]，因此油用牡丹种植在全国迅速发展起来。现阶段作为油用牡丹开发的牡丹品种主要是‘凤丹’和栽培紫斑牡丹[12]。这两类品种分别属于江南牡丹品种群和西北牡丹品种群[11,13]，两者原产地气候类型迥异，但因两类牡丹结实能力较强[12]，在全国多地都有引种栽培。研究表明，相同作物的不同品种类型对环境的适应能力会有明显差异[14，15]，同时环境因素对于作物的品质和产量都会产生较为明显的影响[16-18]，油用牡丹产业虽然发展势头迅猛，但关于其基础性研究相对薄弱，研究主要集中在牡丹籽油的脂肪酸组分及加工提取工艺上[19-21]，对不同品种、不同地区牡丹的产量、油脂品质等油用牡丹的整体资源状况的了解还基本处于空白阶段，因此有必要对不同产地及不同品种的油用牡丹的油脂品质进行评价，为油用牡丹产业健康发展提供参考。本研究通过对不同产地‘凤丹’和紫斑牡丹种子脂肪酸组分的比较，探究两类主要油用牡丹品种籽油脂肪酸的特点和差异，并分析了脂肪酸组分与环境因子的关系，以期为不同地区油用牡丹品种的选择提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2015年8—9月选取环境差异较大的油用牡丹产地河南洛阳、湖北保康、陕西西安、甘肃兰州、北京和西藏拉萨采收油用牡丹种子。每个产地选取同一块样地中果实发育正常的‘凤丹’和紫斑牡丹成熟果荚，每个品种分布选取至少10个不同单株的果荚，2个品种分别用网袋封装，挂号标签，放置与实验室内自然风干，待果荚自然开裂后取出种子。采收果荚的同时使用手持GPS测定采样点的经纬度和海拔，年降雨量和年平均气温数据来源于中国气象局国家气象信息中心(http://cdc.cma.gov.cn)，各样地环境生态因子见表1。

表1 油用牡丹样地的生态环境因子

1.2 种子百粒质量测定

将自然风干的种子置于45 ℃烘箱中烘干48 h，后称取每份样品的百粒质量。百粒质量的测定方法为：首先将每份样品中的干瘪种子去除，后随机从中选取100粒种子称取质量，每份样品重复进行3次百粒质量测定。

1.3 脂肪酸成分分析

取干燥后的种子去掉种皮，种仁用冷冻研磨机进行粉碎用于后续实验。脂肪酸成分的提取和检测参考曾秀丽等[23]的方法。准确称取约0.50 g样品粉末于 10 mL玻璃试管中，后加入 3.0 mL 氯仿:甲醇溶液(体积比为1∶2)，充满氮气后漩涡振荡混匀；4 ℃静置过夜，后补充1.0 mL的氯仿；混匀后再加入 1.8 mL 的1 mol/L KCl 溶液，充分振荡后2 500 r/min 离心10 min，吸取下层氯仿相 1.0 mL；用氮气吹干氯仿后加入1.0 mL 硫酸甲醇溶液(5%硫酸+95%甲醇)，充氮气后密封；将试管在90 ℃水浴 1 h；冷却至室温后加入1.5 mL 正戊烷和 1.0 mL水终止甲基化反应；振荡后2 500 r/min 离心10 min，收集上清液；氮气吹干后加入 5.0 mL 重蒸的正己烷，取1.0 mL 提取液，用0.22 μm 尼龙微孔滤器过滤到样品瓶中，每个样品中加入10 μL内标(4 mg/mL十七烷酸甲酯正己烷溶液)。

所用分析系统为GC/MS-QP5050A 气质联用仪，色谱柱为 Supelco SP-2560 (100 m×0.25 mm×0.20 μm)。分析脂肪酸所用的升温程序如下：100 ℃保持5 min，然后以4 ℃/min升温至240 ℃，保持15 min；载气：氦气，纯度≥99.999%，流速为1 mL/min；进样口温度程序：250 ℃，进样方式：不分流，进样量1 μL；溶剂切除时间12.5 min，检测器电压：0.1 kV；GC-MS接口温度：250 ℃。采用 NIST05 Library 标准谱库检索和与标准品比对定性。

1.4 脂肪酸的定量分析

牡丹种子油中5个主要成分为棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和α-亚麻酸，利用内标标准曲线法进行定量分析，以牡丹种子油中不存在的十七烷酸作为内标。配制不同质量浓度的5个标准品，包括 0.015 625～1.0 mg/mL等7个浓度，制作的标准曲线公式见表2。样品中其他微量成分仅用内标相对定量。

表2 牡丹种子中5种主要脂肪酸的标准曲线

1.5 数据的统计分析

利用SPSS 19.0和Excel 2010对数据进行方差分析、差异显著性分析和相关性分析。

2 结果与分析

2.1 主要脂肪酸的定性分析

利用建立的GC-MS方法对不同产地的牡丹籽油脂肪酸成分进行定性分析(图1)，比较脂肪酸甲酯混合标准品与样品的色谱峰保留时间，根据相关色谱的离子质量，确定主要脂肪酸的种类(表3)，同时也检测到部分微量脂肪酸：十五烷酸(C15H30O2，32.532 min)、棕榈一烯酸(C16H30O2，35.591 min)、十七烷一烯酸(C17H32O2，37.155 min)、花生酸(C20H40O2，40.579 min)、γ-亚麻酸(C18H30O2，41.381 min)和二十一烷酸(C21H42O2，41.998 min)。

注：PA：棕榈酸，IS：内标(十七烷酸)，SA：硬脂酸，OA：油酸，LA：亚油酸，ALA：α-亚麻酸。图1 样品脂肪酸甲酯的总离子流图

表3 样品种子中脂肪酸组分的GC-MS分析

2.2 不同产地两种牡丹种子百粒质量研究

对6个产地的‘凤丹’和紫斑牡丹种子百粒质量统计后发现(表4)，不同样品百粒质量存在显著性差异。所有样品种，洛阳产‘凤丹’种子的百粒质量最大，平均(32.69±0.44) g，兰州产‘凤丹’种子的百粒质量最小，平均为(19.56±0.33) g，比最高百粒质量减少了约40%。不同产地‘凤丹’种子百粒质量平均在(9.56～32.69) g之间，平均为25.21 g，样品之间差异显著；不同产地紫斑牡丹种子百粒质量平均在(24.32～25.39) g之间，不同产地之间种子质量变化较小，差异不显著。

表4 不同产地‘凤丹’和紫斑牡丹种子百粒质量、脂肪酸含量/mg/g(D.W.)

分析牡丹百粒质量与环境因子的相关性(表5)发现，百粒质量与纬度呈现显著正相关，与海拔表现显著负相关，即海拔越高，种子百粒质量越小。

表5 牡丹种子百粒质量及脂肪酸组分与环境生态因子相关性

2.3 不同产地两种牡丹种子脂肪酸组分研究

本研究通过GC-MC检测到‘凤丹’和紫斑牡丹籽油脂肪酸主要成分5种：α-亚麻酸、亚油酸、油酸、棕榈酸和亚麻酸(表4)，与前人关于油用牡丹籽油成分的研究结果一致[17-20]。油用牡丹籽油各组分含量的结果显示，‘凤丹’和紫斑牡丹籽油均富含不饱和脂肪酸，不饱和脂肪酸占总脂肪酸含量的85%以上，其中α-亚麻酸含量最高，平均为(57.25±8.11) mg/g，与前人的研究结果一致[15,17，18]，但不同样本之间存在差异，其中保康紫斑牡丹籽油α-亚麻酸含量最高(75.61±7.70) mg/g，兰州紫斑牡丹含量最低(43.57±2.70) mg/g；不同种及不同产地油用牡丹籽油中油酸和亚油酸含量存在差异，12份样品的油酸含量平均值(28.84±7.80) mg/g高于亚油酸含量(25.82±7.75) mg/g。洛阳和兰州产‘凤丹’亚油酸含量高于油酸含量，其他样品都表现为油酸含量高于亚油酸含量。韩雪源等[17]分析了7个不同产地的‘凤丹’籽油脂肪酸含量，7个产地的牡丹籽油中亚油酸含量均高于油酸含量；该研究所用样品仅有洛阳产地与本研究相同，同时本研究的洛阳产‘凤丹’确实表现出亚油酸含量高于油酸含量。李莉莉等[23]对兰州产紫斑牡丹籽油脂肪酸组分分析发现，紫斑牡丹籽油的油酸含量高于亚油酸含量，Li等[15]利用GC-MS分析了60个栽培牡丹及2个野生牡丹(杨山牡丹和紫斑牡丹)籽油脂肪酸组分，也发现部分品种表现为油酸含量高于亚油酸含量，两个野生种中，杨山牡丹亚油酸含量高于油酸含量，而紫斑牡丹相反。‘凤丹’和紫斑牡丹这两类油用牡丹品种其主要形成亲本不同，研究根据形态及分子生物学证据，认为‘凤丹’是由野生种杨山牡丹(P.ostii)独立驯化选育出的品种[24，25]；栽培紫斑牡丹是由分布于西北地区的野生紫斑牡丹(P.rockii)与中原等地的栽培牡丹(P.suffruticosa)经过反复杂交形成的品种群，即西北牡丹品种群(紫斑牡丹品种群)[11,24,26]。‘凤丹’长期以来作为重要的中药‘丹皮’的主要来源，同时也是牡丹嫁接使用的重要砧木，在各个牡丹产区都广泛种植，通过自然授粉获得种子生产种苗[12]，因此在长期的驯化栽培过程中必然会与产地的其他种质资源产生基因交流，导致变异的产生，因此不同产地‘凤丹’油酸和亚油酸含量存在明显不同也是合理的。饱和脂肪酸在牡丹籽油中含量较少，主要包含棕榈酸和硬脂酸。

对同一种类牡丹籽油在不同产地的比较发现(表3)，‘凤丹’籽油α-亚麻酸含量和总不饱和脂肪酸含量在不同产地之间含量相对稳定，不存在显著差异；总脂肪酸含量除洛阳外，其他5地也不存在显著差异；油酸含量兰州和拉萨含量较低，与其他4个产地差异显著；亚油酸含量洛阳明显高于其他产地，与其他5个产地形成显著差异，而其他5个产地之间差异不显著。紫斑牡丹籽油α-亚麻酸含量、总不饱和脂肪酸含量和总脂肪酸含量在不同产地之间存在差异，其中西安、兰州和拉萨三地之间差异不显著，与其他三地的差异显著；油酸与亚油酸含量的比较发现：洛阳、保康和北京之间无显著差异，西安、兰州和拉萨不存在显著差异，但前3个产地与后3个产地之间存在显著差异。本研究的6份紫斑牡丹材料来自紫斑牡丹2个亚种，即太白山紫斑牡丹(P.rockiisubsp.atava)和全缘叶紫斑牡丹(P.rockiisubsp,rockii)[27]的杂交后代，保康紫斑牡丹属于全缘叶紫斑牡丹的杂交后代，其他地区的属于太白山紫斑牡丹杂交后代。不同的种源可能是导致脂肪酸成分差异的重要原因。

对相同产地的不同种类牡丹籽油成分含量分析发现，总脂肪酸含量、总不饱和脂肪酸含量、α-亚麻酸含量、亚油酸含量、硬脂酸含量和棕榈酸含量除保康和北京两产地是紫斑牡丹高于‘凤丹’外，其他产地均表现为‘凤丹’高于紫斑牡丹，除洛阳两份样品亚油酸含量和硬脂酸含量存在显著差异外其他指标同一产地两类牡丹之间不存在显著差异。油酸含量洛阳、保康和北京表现为紫斑牡丹高于‘凤丹’，其他3个产地为‘凤丹’高于紫斑牡丹，除西安外，其他5个产地各脂肪酸组分之间不存在显著差异。相同品种在不同的产地种子质量及脂肪酸含量存在明显的差异，这与前人的研究结果一致[17]。几个产地中洛阳的海拔最低，开花最早(4月中旬开花)，兰州和拉萨的海拔最高，开花最晚(约在5月中下旬开花)，而高海拔地区夏季较短，气温下降较早，导致牡丹种子成熟时间在不同产地之间较为接近，这也导致了高海拔地区的油用牡丹种子生长发育时间较低海拔地区减少了约一个月。Li等[28]通过分析牡丹种子不同发育时期的脂肪酸组分变化发现在种子发育的前90 d中，各脂肪酸组分含量都在不断增加，本研究中兰州和拉萨所产牡丹籽油脂肪不饱和脂肪酸及饱和脂肪酸含量均较其他产地的减少，最多减少了约47%，这可能与种子发育时间较短有关。紫斑牡丹生育期明显较‘凤丹’短，种子成熟期较‘凤丹’早约15 d，甚至更长，这也进一步导致其脂肪酸含量偏低。

对牡丹籽油脂肪酸组分与环境因子相关分析发现(表5)：脂肪酸组分含量与纬度、年降雨量和年平均气温表现为显著正相关(P<0.05)，与海拔表现为显著负相关(P<0.05)(表5)，而经度对脂肪酸组分含量影响不大，两者相关性不显著。环境因子对牡丹的生长发育是相互影响且相互制约的，多重环境因子的共同作用最终导致不同产地的牡丹年生育期产生了明显差异，最终也导致了其种子产量及脂肪酸含量的不同，在牡丹年生育期较短地区牡丹种子质量及脂肪酸含量都会有明显下降。

3 结论

6个不同产地的‘凤丹’和紫斑牡丹主要成分为α-亚麻酸、亚油酸、油酸、棕榈酸和亚麻酸，其中α-亚麻酸含量在所有样品中均最高。不同产地不同样品的五种主要脂肪酸含量存在显著差异，其中洛阳和兰州产凤丹种子的亚油酸含量高于油酸含量，而其他产地的凤丹亚油酸含量低于油酸含量，此外六个居群中亚油酸含量均低于油酸含量。6个产区‘凤丹’种子的脂肪酸含量在104.01～162.21 mg/g之间变化，海拔越高，脂肪酸含量越低，六个产区紫斑牡丹种子脂肪酸含量在85.87～172.73 mg/g之间变化。其中保康产紫斑牡丹籽油α-亚麻酸含量、不饱和脂肪酸含量及总脂肪酸含量都是最高的。对6个产地两类油用牡丹比较后发现，相同产地的‘凤丹’种子在百粒质量、总脂肪含量、不饱和脂肪酸含量等地方普遍高于紫斑牡丹。现阶段主流油用牡丹栽培品种在高海拔地区均表现为种子质量、亚麻酸、总不饱和脂肪酸、总脂肪酸含量降低，这主要与高海拔地区牡丹种子生长发育周期缩短有关，因此现阶段推广的油用牡丹品种在高海拔地区推广需谨慎考虑，不可盲目大规模发展油用牡丹。