2016—2019 年广西玉林市部分猪场主要病毒性疫病监测

陈忠伟，何文娜，2，何 颖，段振华，卢冰霞，段群棚，甘甲忠，赵 武，甘一波，全琛宇，黄 宇

（1.广西壮族自治区兽医研究所，广西兽医生物技术重点实验室，广西南宁 530001；2.广西大学，广西南宁 530005；3.玉林市动物疫病预防控制中心，广西玉林 537000）

近年来，随着养猪场的规模化、集约化发展，猪群饲养密度日益增大，加之生产周转加快、健康养殖技术滞后等原因，造成广西部分地区多种猪病流行，尤其是病毒性疫病，对养猪业危害日趋严重。其中，猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒2 型（PCV2）和猪伪狂犬病病毒（PRV）等是养猪业中常见的病毒性疫病病原[1-2]。这4 种病原单独或混合感染均能引起猪群的繁殖障碍或呼吸道疫病，具有传播速度快、危害性大、消灭困难、隐性带毒、易复发等特点[2-6]，对猪场造成了严重经济损失。2015—2019 年，段群棚等[7]从广西14 个地市规模猪场采集1 114 份具有呼吸道症状病猪样品进行检测，发现该地区猪呼吸道疫病多发且以多病原混合感染为主，其中PRRSV 检出率最高，PCV2 次之；同年黎军[4]等也发现，广西生猪主产区以及中小型猪场的PRRSV、PRV、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、CSFV 和PCV2 等病原的感染情况较为严重。玉林市生猪养殖量位于广西前列，上述几种主要病毒性疫病的防控形势依然严峻。为了解玉林市此类病原的感染情况，本研究对2016—2019 年从玉林市规模化猪场采集的血清和组织样本进行了CSFV、PRRSV、PCV2 和PRV 4 种病原的血清学和病原学检测，以期为玉林市乃至整个广西地区主要猪病毒性疫病的有效防控提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 血清样本 2016—2019年，每年春季（4月）、秋季（10 月）集中免疫3 周左右进行采样。采样时，按照《自治区农业农村厅关于印发2019 年广西壮族自治区动物疫病监测与流行病学调查计划的通知》（桂农厅发〔2019〕129 号）和玉林市动物疫病监测计划要求（玉市农发〔2019〕22 号），对玉林市7 个县（市、区）规模猪场，采取简单随机抽样方式，按比例分配到各县（市、区），每个场采集20～30 份血清样品。每份血清样品不少于2 mL，并且清亮、无融血。3 年间共检测284 个场次的6 954 份血清样品。其中，2019 年由于开展风险评估抽样检测，采集的血清样品数有所减少。

1.1.2 组织样本 按照1.1.1 中相关文件要求，以玉林市7 个县（市、区）母猪存栏200 头以上规模化猪场的临床健康猪群为目标群，根据各县（市、区）目标群数量，按比例确定采样猪场数量后，采取简单随机抽样方式确定抽取的场群，每个场群采集样品不少于10 份（屠宰时采集），具体数量按照场群规模确定。2016—2019 年，在玉林市7 个县（市、区）采集113 个场次的1 539 份临床健康猪群组织（肺脏、淋巴结、脾脏）样品。在此期间，还有自主送检的249 个场次536 份病死猪组织病料（肺脏、淋巴结、脾脏）样品。每份样品包括颌下淋巴结2个、脾脏50 g 和肺脏50 g。对上述组织样品均进行CSFV、PRRSV、PRV、PCV2 检测。

1.1.3 主要试剂 CSFV、PRRSV、PRV、PCV2抗体检测试剂盒，均购自北京金诺百特科技有限公 司；DL 2 000 DNA Marker、PremixTaqTM（ExTaqTMVersion 2.0 plus dye）、PrimeScriptTMOne step RT-PCR Kit Ver.2，均为大连宝生物工程有限公司产品；病毒基因组DNA/RNA 快速抽提试剂盒，为TIANGEN 生物科技有限公司的TGuide S32 磁珠法病毒DNA/RNA 抽提试剂盒。

1.2 方法

1.2.1 检测 采用ELISA 法检测CSFV、PRRSV、PCV2、PRV-gB 血清抗体，采用PCR/RTPCR 方法进行上述4 种病原的抗原检测。

1.2.2 引物设计与合成 根据GenBank 中公开发表的各病毒基因序列，利用Meg Align（DNAstar），Primer Premier 7.0 软件设计引物（表1）。上述引物均送至生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.3 组织样本处理及病毒DNA/RNA 提取 取送检的组织样本（每头猪的淋巴结、脾脏和肺脏混合为1 份样品），按质量比1:5 加入生理盐水，在组织研磨仪内研磨，反复冻融3 次，4 ℃条件下10 000 r/min 离心5 min 后取上清，进行DNA/RNA抽提或保存于-70 ℃冰箱备用。按照TGuide S32磁珠法病毒DNA/RNA 抽提试剂盒说明书，对样品上清进行DNA/RNA 提取，对所获得的DNA/RNA直接进行PCR/RT-PCR 检测或置于-70 ℃保存。

1.2.4 CSFV 和PRRSV 的RT-PCR 检测 利用特异性引物对提取的样品RNA 进行一步法RT-PCR扩增。RT-PCR 扩增体系25.0 μL：PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1.0 μL，2×1 Step Buffer（Dye Plus）12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，RNA 模板5.0 μL，ddH2O 5.5 μL。RT-PCR 扩增反应条件：50 ℃30 min，94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，按表1 退火温度退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35 个循环；72 ℃延伸10 min。反应结束后，取10 μL PCR扩增产物进行1.0 琼脂糖凝胶电泳检测，并在凝胶成像系统上观察结果并拍照。

表1 引物信息

1.2.5 PCV2、PRV 的PCR 检测 利用特异性引物对提取的样品DNA 进行PCR 扩增。PCR 扩增体系25.0 μL：PremixTaq12.5 μL，DNA 模板5.0 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O 7.0 μL。PCR 扩增反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，按表1 退火温度退火40 s，72 ℃延伸70 s，共35 个循环；72 ℃延伸10 min。电泳及结果观察同1.2.4。

1.2.6 数据分析 检测数据用SPSS 软件（卡方检验）进行显著性差异分析，判断标准为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 RT-PCR/PCR 检测

各病原经特异性引物扩增，PCR 产物电泳后，在紫外线光下可观察到大小分别为288 bp（CSFV）、738 bp（PRRSV）、1 154 bp（PCV2）和217 bp（PRV）的目的条带（图1），均与预期片段大小相符，表明本试验设计的引物特异性强。

2.2 血清学检测

2.2.1 不同年份 统计结果（表2）显示：2016—2019 年CSFV、PCV2、PRV-gB 场群平均抗体阳性率以及个体平均抗体阳性率均在70% 以上。其中：CSFV、PCV2 抗体阳性率整体呈上升趋势，2018年以来CSFV 保持在90%以上，PCV2 在80%以上；PRRSV 抗体阳性率总体偏低，但2019 年场群平均抗体阳性率以及个体平均抗体阳性率均在90%以上；PRV-gB 抗体阳性率总体较为平稳，抗体阳性率大多维持在80%～88%。

图1 4 种病原RT-PCR/PCR 检测结果

2.2.2 不同地区 统计结果（表3）显示：2016—2019 年，玉林市各县（市、区）的CSFV 群体及个体抗体阳性率均在75%以上，其中北流市场群阳性率（80.00%）和个体阳性率（78.06%）最低，与其他地区有显著差异（P＜0.05）；北流市、福绵区、玉州区的PRRSV 场群抗体阳性率未超过70%，显著低于其他地区（P＜0.05）；玉林市各县（市、区）的PCV2 抗体阳性率均在70%以上，无显著性差异（P＞0.05）；福绵区的PRV-gB 抗体阳性率最低（P＜0.05），未达到70%，其他6个地区均在70%以上。

表2 2016—2019 年玉林市规模化猪场主要病毒性疫病抗体阳性率统计 %

2.3 病原学检测

2.3.1 不同年份 统计结果（表4～5）显示：2016—2019 年，规模猪场健康猪及病死猪组织样品中均检出CSFV、PRRSV、PCV2 和PRV。其中：健康猪组织样品中的PRRSV 和PCV2 抗原阳性率较高（场群总抗原阳性率分别为27.43%、26.55%，个体总抗原阳性率分别为6.37%、4.81%），其次是PRV（分别为12.39%、2.92%），CSFV 最低（分别为4.42%和0.58%）；不同年份的健康猪组织样品中，CSFV 抗原阳性率基本稳定，PRRSV、PRV波动较大，PCV2 有加重趋势。病死猪组织样品中，各病原的分布规律和变化趋势与健康猪组织基本相符，但阳性检出率均高于健康猪。

表3 各县（市、区）规模化猪场主要病毒性疫病抗体阳性率统计 %

表4 不同年份规模化猪场健康猪组织样品检测结果 %

表5 不同年份规模化猪场病死猪组织样品检测结果 %

2.3.2 不同地区 健康猪群统计结果（表6）显示：玉林市各县（市、区）CSFV 场群和个体抗原阳性率均无显著差异（P＞0.05），PRRSV、PCV2 和PRV 的场群抗原阳性率无显著差异（P＞0.05），但个体抗原阳性率差异均有统计学意义（P＜0.001）。病死猪群统计结果（表7）显示：各县（市、区）的CSFV、PCV2 以及PRV的场群和个体抗原阳性率差异均无统计学意义（P＞0.05），各县（市、区）的PRRSV 场群抗原阳性率差异无统计学意义（P＞0.05），但个体抗原阳性率差异有统计学意义（P＜0.001）。

表6 不同地区规模化猪场健康猪组织样品检测结果 %

表7 不同地区规模化猪场病死猪组织样品检测结果 %

3 讨论

猪瘟（CSF）具有高度传染性，目前主要通过接种疫苗防制[9]。自2007 年以来，随着我国CSF强制免疫的全面铺开，CSF 得到了有效控制，因而在2017 年国家取消了CSF 强制免疫，实施差别化免疫策略[10]。本次调查发现，2016—2019 年广西玉林市CSFV 抗体一直保持较高水平，且整体呈现上升趋势，表明玉林市规模化猪场CSF 免疫预防工作效果良好，取消强制免疫对其影响不大，规模猪场仍重视CSF 的免疫预防。但玉林市各县（市、区）仍有CSFV 抗原被检出，临床健康猪场群和个体的抗原阳性率分别为3.13～5.88%和0.30～1.11%，说明玉林市的规模化猪场还存在一定程度的显性及隐性感染，存在疫情散发风险。出现这种现象可能有以下原因：（1）部分猪场免疫程序不合理导致机体免疫力下降或免疫有效期缩短；（2）过分强调季节性免疫或春秋防集中性免疫，而忽视了夏冬季节出生的猪只，导致漏免。因此，各地区各猪场应根据自身实际情况，制定科学合理的免疫防控方案，并定期进行抗体水平监测，以降低CSF 发生概率。

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）目前主要采取疫苗免疫防控，但防控效果不理想，病毒感染长期存在[11-12]。唐小明等[13]认为，这是由于PRRSV变异快，不同地区流行毒株存在一定差异所致。吴佳俊等[14]通过动态监测发现，2015 年我国 PRRS疫情出现了反弹，种猪场群与个体阳性率均出现了大幅上升。本次调查发现，2016—2019 年玉林市猪场的场群免疫抗体阳性率连续3 年低于70%，说明PRRS 免疫效果欠佳。但同时发现，该地区PRRSV 病原检出率较高，并且呈波动上升趋势。由此说明，广西玉林市PRRS 疫情发生风险较高。从区域分布来看，博白、陆川、兴业等主要生猪养殖县的PRRS 病原检出率相对较高。究其原因可能是这些县区生猪养殖量大且以小散养户为主，散养户与规模场相互交织分布，而大部分小散养户管理不规范，生物安全防控意识薄弱。因此，玉林市规模猪场在当前的养殖大环境下，单纯依靠疫苗免疫难以达到预期的保护效果，必须加强生物安全防控，采取严格的生物安全措施、科学合理的免疫程序、有效的净化根除计划等，只有这样才能达到良好的防控效果[15]。同时，玉林市各县（市、区）疫病防控相关部门需要加强生物安全防控知识培训与宣传，提高各养殖场（户）防控意识。

圆环病毒病是危害广西养猪业的主要疫病之一。PCV2 可引起断仔奶猪多系统衰竭综合征，可致断奶仔猪和育肥猪出现生长缓慢和间质性肺炎等症状，可经呼吸道感染不同日龄的猪，少数怀孕母猪感染后可经胎盘垂直感染给仔猪[16-17]。本次调查发现，玉林市规模化猪场的PCV2 免疫抗体虽能达较高水平，但病原检出率也较高，仅次于PRRSV，与之前黎军等[4]、段群棚等[7]报道的PCV2 在广西地区全年的发病率均处于较高水平，且夏季发病率最高的结果相符。这可能与广西夏季持续时间长及猪群密度过大等有关，即猪群在高湿闷热的环境下容易产生应激，导致猪群整体免疫力下降，患病率随之升高。此外，PCV2 属于免疫抑制性病原，猪本身体质会对疫苗免疫效果有一定影响。因此，在做好PCV2 免疫接种的同时，需重视猪群饲养管理，进行综合防控，这样才能取得理想的疫病防控效果。

猪伪狂犬病（PR）是我国目前猪群疫病中优先净化的病种之一，且已取得了一定的防控成效，其中种猪群净化是防控关键[13，18]。此次调查发现，虽然2016—2019 年广西玉林市PR 免疫效果较好，但病原阳性率波动较大，说明玉林市较多猪群仍受PRV 威胁。造成这一现象的原因一方面可能是引种问题，另一方面可能是PRV 变异株的出现，造成传统疫苗保护率下降。因此，目前防控和净化PR 的关键问题是种猪PR 净化，对猪场新引进的种猪应进行抗体检测，同时定期做好抗原抗体监测工作[19]。

目前，对于规模化猪场来说，CSFV、PRRSV、PCV2、PRV 都有较高的感染风险，要定期对这些重要病原进行监测，及时淘汰带毒猪；在发现疫情后要及时上报，迅速隔离，尽快确定致病源，并对健康猪群进行紧急免疫接种，病死猪全部深埋并无害化处理，有条件的猪场可以将阳性猪全部淘汰，以控制传染源，逐步净化猪群[20]；坚持猪群全进全出制度，实施封闭式管理，以有效控制猪传染病的发生及传播[21]。本次调查所采集样品来自玉林市7 个县（市、区）的部分规模猪场，在一定程度上可以反映本市规模猪场4 种疫病的免疫水平及感染状态。本调查的局限性就在于采样过程中场内抽样并不能做到完全随机，且抽样场群数量依照计划按比例分配，未进行系统采样设计，这样可能会出现抽样系统误差。同时，抗体检测无法区分是免疫抗体还是感染抗体，也会导致本次结果出现偏差。

4 结论

监测发现，2016—2019 年玉林市规模化猪场CSFV、PRRSV、PCV2、PRV 4 种病原的免疫抗体保护水平总体较高，但部分县（市、区）水平偏低，且均存在猪群带毒现象，因此疫病暴发风险仍然存在。因此，各县（市、区）要根据本地养殖情况及疫病流行情况，制定严格合理的免疫计划，加强综合防控，持续做好监测，切实做好猪场疫病防控。