柑橘精油纳米乳的制备及对金黄色葡萄球菌的抑制活性研究

蒋书歌 侯宇豪 刘 坚 李高阳 付复华 单 杨

(1. 湖南大学研究生院隆平分院，湖南 长沙 410125；2. 湖南省农业科学院农产品加工研究所，湖南 长沙 410125；3. 果蔬贮藏加工与质量安全湖南省重点实验室，湖南 长沙 410125；4. 果蔬贮藏加工与质量安全国际联合实验室，湖南 长沙 410125)

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是一种常见的食源性致病菌，可造成呕吐腹痛等症状，因此市售食品中往往会添加一些防腐剂抑制金黄色葡萄球菌的生长[1]。随着人们对健康、绿色食品的追求，天然抑菌剂成为一种趋势。柑橘精油主要存在于柑橘外果皮的油囊中，可通过蒸馏、冷榨或萃取等技术提取。柑橘精油富含柠檬烯、松油烯、月桂烯等抑菌活性成分[2]，可作为理想的天然抑菌剂替代亚硝酸钠、苯甲酸钠等传统防腐剂[3-4]。然而，柑橘精油水溶性差、易挥发、易氧化，极大地限制了其应用范围。

纳米乳是一种非热力学稳定的胶体分散体系，粒径一般为10～100 nm[5]，根据油或水作为分散相，分为水包油型、油包水型、双连续型3种[6]。纳米乳具有良好的动力学稳定性，其乳中乳化剂及其他助乳化剂的存在，降低了油水界面张力[7]，同时，缩小粒径至纳米级别可减少液滴聚集、絮凝和引力作用从而显著提高乳液稳定性[8]。将精油制备成纳米乳能提高精油的水溶性，使得亲脂性成分快速融入以水为主要溶剂的食品生产体系[9-11]。另外，纳米乳具有高分散性、高渗透性等优点，提高了精油的抗菌、抗氧化等生物活性[12-13]。

研究拟以8种柑橘精油为原料，金黄色葡萄球菌为受试菌种，通过抑菌圈大小筛选合适的柑橘精油作为油相，并以吐温80为乳化剂，去离子水为水相，利用相转变法制备柑橘精油纳米乳并确定最佳配方。根据平均粒径、多分散相系数、粒度分布对柑橘精油纳米乳稳定性进行评价，通过抑菌圈直径、最小抑菌浓度、最小杀菌浓度以及扫描电镜比较柑橘精油纳米乳和纯精油的抑菌活性，旨在为柑橘精油作为一种天然食品抑菌剂的开发与应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

佛手柑：产地浙江省金华市，市售；

甜橙：产地云南省玉溪市，市售；

酸橙：产地湖南省涟源市，市售；

蜜柚：产地福建省漳州市，市售；

沙田柚：产地广西省容县，市售；

金桔：产地广西省阳朔县，市售；

蜜橘：产地湖南省石门县，市售；

帝王柑：产地广东省德庆县，市售；

金黄色葡萄球菌：广东省微生物培养中心；

无水硫酸钠：分析纯，天津市恒兴化学试剂制造有限公司；

吐温80：化学纯，国药集团化学试剂有限公司；

苏丹红III：化学纯，上海麦克林生化科技有限公司；

LB肉汤培养基、LB琼脂培养基、MH琼脂培养基：广东环凯微生物科技有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

恒温恒湿培养箱：LHS-250HC-11型，上海一恒科学仪器有限公司；

空气浴摇床：TS-100B型，金坛市精达仪器制造有限公司；

离心机：Avanti 1-26xp型，美国Beckman有限公司；

磁力搅拌器：HJ-6A型，江苏金怡仪器科技有限公司；

气相色谱—质谱联用仪：7890A-5975C型，美国Agilent公司；

扫描电子显微镜：A02100301型，德国Zeiss公司；

激光粒度仪：Zetasizer Nano ZS90型，英国马尔文仪器公司。

1.2 试验方法

1.2.1 柑橘精油的制备 将柑橘皮与4倍质量的水混匀于烧瓶蒸馏3 h，将馏分用无水硫酸钠干燥后置于4 ℃下保存备用。

1.2.2 菌种活化 取甘油管保藏的金黄色葡萄球菌至80 mL 的LB肉汤培养基中，37 ℃，200 r/min震荡培养24 h，取200 μL培养液接入80 mL的LB肉汤培养基，于37 ℃，200 r/min下震荡培养24 h，连续培养2代，用LB肉汤培养基稀释菌体浓度为1×107CFU/mL备用。

1.2.3 柑橘精油的筛选 采用滤纸片[14]法对精油抑菌效果进行比较筛选，取活化的菌液均匀涂布于MH琼脂培养基上。将含有6 μL精油的无菌圆盘滤纸片置于平板，不含精油的空白滤纸片作为对照，平板于37 ℃培养24 h，测定抑菌圈大小。

1.2.4 柑橘精油化学成分测定 参照苏瑾等[15]的方法，通过气相色谱—质谱(GC-MS)分析柑橘精油化学成分。

1.3 柑橘精油纳米乳的制备

1.3.1 伪三元相图绘制 采用相转变法制备柑橘精油纳米乳[16]。固定柑橘精油和吐温80的质量为2 g，按m乳化剂∶m精油分别为9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8，1∶9于烧杯中混匀，25 ℃、500 r/min 下磁力搅拌，以1 mL/min的流速依次向烧杯中滴加去离子水，当烧杯中溶液由澄清变浑浊再变澄清时，即为相转变点，记录此时所滴加的去离子水质量，并计算各组分在相转变点的质量分数，用Origin 8.0绘制伪三元相图。

1.3.2 纳米乳平均粒径、多分散相系数(PDI)及粒度分布测定 将样品用去离子水稀释100倍以避免多重散射的影响，使用马尔文激光粒度仪测定乳液的平均粒径、PDI及粒度分布，测定条件为温度25 ℃，散射角173°、平衡时间5 min、测试时间5 min。

1.4 柑橘精油纳米乳抑菌性

1.4.1 纳米乳抑菌活性

(1) 纳米乳抑菌圈直径:取活化后的菌液100 μL均匀涂布于MH琼脂培养基上。将含有20 μL纳米乳或普通乳液的无菌圆盘滤纸片置于平板，其中普通乳液中各组分含量与纳米乳一致，通过初步混合制备。空白组添加含24%吐温80的稀释液。平板于37 ℃下培养24 h，测定抑菌圈大小。

(2) 纳米乳最小抑菌浓度:参照Guo等[14]的方法采用倍半稀释法分别测定柑橘精油纳米乳及对应浓度纯精油的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。

1.4.2 纳米乳对微生物微观结构的影响 参照Moghimi等[17]的方法用扫描电镜(SEM)观察经纳米乳处理后的金黄色葡萄球菌的形态变化。

1.5 统计分析

所有试验数据均以“平均值±标准差”表示。使用GraphPad Prism 8软件进行绘图与ANOVA差异显著性分析(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 柑橘精油的筛选

2.1.1 柑橘精油抑菌性 由图1和表1可知，抑菌圈直径大小分别为佛手柑>蜜柚>甜橙>帝王柑>沙田柚>金桔>酸橙>蜜橘，且佛手柑、蜜柚、甜橙三者抑菌圈大小无显著性差异，因此筛选出抑菌效果较好的佛手柑、蜜柚、甜橙精油进一步试验。

2.1.2 柑橘精油化学成分 由表2可知，分别鉴定了3种精油中的30种化合物，其分别占出峰总物质的97.74%(佛手柑)，98.86%(甜橙)，98.46%(蜜柚)。佛手柑精油的主要化合物为γ-松油烯(35.97%)、D-柠檬烯(32.79%)、3-蒈烯(5.15%)；甜橙精油的主要化合物为D-柠檬烯(73.86%)、β-月桂烯(7.65%)、β-水芹烯(3.21%)；蜜柚精油的主要化合物为D-柠檬烯(56.52%)、β-月桂烯(26.82%)、β-蒎烯(4.72%)。据报道[18-19]，γ-松油烯和D-柠檬烯具有广谱抑菌效果。此外，蒈烯、月桂烯及β-蒎烯等其他主要成分也具有较好的抑菌活性[20-22]。

图1 8种柑橘精油对金黄色葡萄球菌抑菌效果图Figure 1 Diagram of the antibacterial effect of eight citrus essential oils on Staphylococcus aureus

2.2 柑橘精油纳米乳的制备

2.2.1 伪三元相图的绘制 由图2可知，当m乳化剂∶m精油为5∶5，4∶6，3∶7，2∶8，1∶9时，佛手柑精油纳米乳无相转变，当m乳化剂∶m精油为4∶6，3∶7，2∶8，1∶9时，甜橙、蜜柚精油纳米乳无相转变，这些情况下均无法形成纳米乳。由于载油量越大抑菌活性越强，因此选择载油量最大的组合作为纳米乳最优配方。当m乳化剂∶m精油为8∶2时，佛手柑清油、甜橙精油、蜜柚精油3种乳液中精油均具有最大质量比，分别为(5.97±0.00)%，(6.79±0.00)%，(6.17±0.00)%，故选取m乳化剂∶m精油为8∶2制备乳液。为避免载油量差异对后续抑菌试验造成偏差，将3种纳米乳的配方统一设定为精油质量分数6%、吐温80质量分数24%、水质量分数70%。

2.2.2 纳米乳平均粒径、PDI及粒度分布 在确定最佳配方基础上，制备3种柑橘精油纳米乳，分别测定其平均粒径、PDI及粒径分布，结果见表3、图3。

由表3可知，佛手柑精油、甜橙精油、蜜柚精油3种纳米乳的平均粒径分别为(15.01±0.85)，(15.36±0.76)，(17.43±0.22) nm，佛手柑与甜橙之间无显著性差异，蜜柚的平均粒径偏大。佛手柑精油纳米乳的PDI显著低于甜橙精油纳米乳和蜜柚精油纳米乳，PDI越小，乳液液滴分布越均匀，体系越稳定，说明佛手柑精油纳米乳相较其他两种纳米乳粒径分布更均匀。粒度分布结果更直观反映了3种纳米乳在稳定性上的差异，其中佛手柑精油纳米乳的粒径分布最窄且呈单峰，说明液滴粒径一致性好。佛手柑精油纳米乳的高稳定性可能与佛手柑精油中高比例极性化合物有关，极性化合物会促进吐温80在液滴界面上的覆盖，从而进一步改善乳化作用并产生相对较强的界面[23]。

表1 8种柑橘精油对金黄色葡萄球菌抑菌圈直径的影响†

表2 3种柑橘精油的化学成分分析

图2 3种柑橘精油纳米乳的伪三元相图Figure 2 Pseudo-ternary phase diagrams of three citrus essential oil nanoemulsions

表3 3种柑橘精油纳米乳的平均粒径及PDI†

2.3 柑橘精油纳米乳的抑菌性

2.3.1 纳米乳抑菌活性 由表4可知，与普通精油乳液相比，3种柑橘精油纳米乳的抑菌圈直径显著增大。佛手柑、甜橙、蜜柚精油的MIC分别为9.375，18.750，18.750 mg/mL，且三者MIC与MBC一致；而佛手柑、甜橙、蜜柚精油纳米乳的MIC分别为3.750，15.000，7.500 mg/mL，MBC分别为3.750，15.000，15.000 mg/mL。3种柑橘精油中，佛手柑精油对金黄色葡萄球菌的抑菌活性最强，甜橙、蜜柚精油抑菌活性无明显差异。将精油制备成纳米乳后，佛手柑精油纳米乳的抑菌效果提升最显著，其MIC、MBC均为纯精油的2.5倍，而另外2种精油纳米乳的抑菌活性也有小幅度的提升。佛手柑精油纳米乳的最高抑菌活性可能与以下两方面有关：①D-柠檬烯是甜橙、蜜柚精油的主要成分，相对于佛手柑精油的主要成分γ-松油烯，其抗氧化能力更强，对氧气更加敏感[18]，纳米乳制备过程中，样品由于空气、磁力搅拌等因素可能在一定程度上造成柠檬烯的损失，导致抑菌效果产生明显差异；② 更稳定的乳液体系能降低乳液在贮藏及加工过程中破乳、分层、聚集等现象的产生，避免乳液成分损失[24]，纳米乳稳定性试验表明，佛手柑精油纳米乳在3种纳米乳中稳定性最好，抑菌过程中有效成分挥发相对较少，因此抑菌效果提升最明显。精油成分上的优势以及纳米乳的高稳定性，可能是佛手柑精油纳米乳表现出较高抑菌活性的主要原因。

图3 3种柑橘精油纳米乳的粒径分布图Figure 3 Diagramsofthe particle size distribution of three citrus essential oil nanoemulsions

表4 金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径、MIC及MBC†

2.3.2 纳米乳对微生物微观结构的影响 由图4可知，与空白对照组和纯精油处理的细胞相比，纳米乳处理的微生物细胞呈现明显的形态学变化。空白对照组的微生物细胞具有光滑完整的表面；精油处理组的微生物细胞形态结构受到较小程度的破坏，某些细胞出现凹陷、变形，但大部分细胞仍完整；而纳米乳处理的微生物细胞呈现大面积不同程度的变形、粘连及破损，有更大范围的凹陷和畸形细胞群体。说明佛手柑精油及其纳米乳对金黄色葡萄球菌均具有良好的抑制作用，且纳米乳的抑菌效果更显著。

3 结论

探究了柑橘精油纳米乳对食源性细菌金黄色葡萄球菌的抑制作用，筛选出了抑菌效果最强的3种柑橘精油(佛手柑、甜橙、蜜柚)。结果显示，当精油质量分数为6%、吐温80质量分数为24%、去离子水质量分数为70%时，制备的纳米乳粒径为10～20 nm且分布较均匀，其中佛手柑精油纳米乳的稳定性最佳。抑菌试验表明，将3种柑橘精油制备成纳米乳后其抑菌活性得到不同程度的提升，其中佛手柑精油纳米乳的抑菌活性提升为纯精油的2.5倍，具有最突出的抑制金黄色葡萄球菌效果，这可能与乳液稳定性及不同品种柑橘精油的成分差异有关。扫描电镜表明，佛手柑精油纳米乳及其纯精油对微生物形态结构都具有破坏作用，且纳米乳的破坏程度更显著。试验制备的佛手柑精油纳米乳对金黄色葡萄球菌具有良好的抑制作用，可作为一种天然抗菌剂进一步开发利用。