消肿止痛合剂对大鼠缺血皮瓣血管再生及VEGF-Dll4/Notch信号通路的影响

姚兴璋, 刘涛, 何志军*, 李兴勇, 宋渊, 李岩, 李金鹏, 陈文, 王海刚, 何元旭

(1.甘肃省中医院 骨科, 甘肃 兰州 730050; 2.甘肃省人民医院 骨科, 甘肃 兰州 730000;3.甘肃中医药大学 中医临床学院, 甘肃 兰州 730020)

随机型皮瓣常被用来覆盖整形和创伤手术中的浅表皮肤缺损，尽快促进血管新生是皮瓣成活的关键.中医药在这方面取得了一定的研究进展[1].前期临床研究发现消肿止痛合剂可显著降低软组织肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6), 促进皮瓣成活，降低转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)炎性因子水平，阻止外伤后炎症介质的释放[2].血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor，VEGF)是血管内皮细胞生长和分化的首要因子，在血管生成过程中非常关键[2-3].通常VEGF指的是VEGF-A，其结合受体包括血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)和受体2(VEGFR2).目前针对中医药通过VEGF-Dll4/Notch信号通路调控皮瓣还少见报道.本研究采用大鼠随意皮瓣模型，利用消肿止痛合剂以及VEGF-Dll4/Notch信号通路阻断剂干预，观察皮瓣成活率，将进一步揭示VEGF-Dll4/Notch信号通路在皮瓣血管再生中的作用机制.

1 材料与方法

1.1 实验材料

4月龄240只SD大鼠，雌雄各半，体质量(200～240) g，购自甘肃省中医药大学动物实验中心，合格证号：SYXK(甘)2016-0012.饲养条件: 环境温度为23 ℃～25 ℃，湿度为60%～70%，给予正常饮水和进食，适应性喂养 1周后开始实验.动物实验符合甘肃中医药大学实验动物伦理委员会制定的动物实验标准. VEGF、Notch1、Dll4抗体(购自Abcam公司), VEGFR抑制剂Axitinib、Notch-1抑制剂MK-0752(购自Selleck公司)，HRP标记的山羊抗兔(购自中杉金桥生物技术有限公司)，Western blot检测试剂盒(索莱宝科技有限公司)，免疫组织化学染色二抗试剂盒、DAB显色试剂盒(博士德生物工程有限公司)，蛋白浓度测定试剂盒(索莱宝科技有限公司)，倒置相差显微镜(OLYMPUS，日本).

1.2 实验方法

1.2.1 分组

将240只大鼠随机分为6组，正常组、假手术组、模型组、消肿止痛合剂组(消肿组)、Axitinib+消肿止痛合剂组(AXI+消肿组)、MK-0752+消肿止痛合剂组(MK+消肿组).每组又分4种不同时间，5 d组、10 d组、15 d组、20 d组，每组10只.

1.2.2 模型建立

除正常组外所有 SD 大鼠禁食 6～8 h.术前行水合三氯乙醛腹腔麻醉，在背部勾勒2 cm×8 cm尾端区域，假手术组按设计线切开皮肤至深筋膜层，不掀起皮瓣。模型组和消肿组将皮肤与筋膜分离，随意皮瓣用4-0丝缝合回原位[3].待麻醉完全恢复后送回饲养笼，进行观察.术后每日早上肌注青霉素 12 万 U，连用3 d.

1.2.3 药物处理

消肿止痛合剂，由甘肃省中医院科研制剂中心生产，注册文号：甘卫普制准字(1997)-202-04，批号：20051122，规格：250 mL/瓶.消肿组每日灌胃服用1 mL/100g (每毫升含生药 0.09g)消肿止痛合剂, AXI+消肿组每日灌胃服用1 mL/100 g消肿止痛合剂和0.03 mg/g的VEGFR抑制剂Axitinib，MK+消肿组每日灌胃服用1 mL/100 g消肿止痛合剂和0.03 mg/g的Notch-1抑制剂MK-0752,模型组、空白组和假手术组每日灌服相应体积的蒸馏水.服药5，10，15和20 d后分批麻醉并处死大鼠，剥离皮瓣组织多聚甲醛固定或-80 ℃保存.

1.2.4 皮瓣成活率

通过透明硫酸纸描绘各组皮瓣形态,坏死区域采用墨汁涂黑.皮瓣存活面积与总面积之比即皮瓣成活率.

1.2.5 免疫组织化学染色

洗涤后，用体积分数3%过氧化氢使内源性过氧化物酶失活，组织抗原用浓度为10.2 mol/L柠檬酸钠缓冲液修复.用质量分数3%牛血清白蛋白阻断30 min.VEGFA抗体，Dll4抗体，Notch-1抗体，在4 ℃下培养过夜.用HRP结合二级抗体(V抗体∶V抗体稀释液=1∶1 000)孵育，3,3′-二氨基联苯胺染色，苏木精复染,脱水封片，显微观察，采集照片.

1.2.6 Western blot 法检验蛋白表达

匀浆，用BCA法以BSA为标准定量蛋白质质量浓度.含有等量蛋白质(60 μg)的样品在质量分数12%凝胶中分离，并电转移到PVDF膜上.用质量分数5%脱脂牛奶封闭后，用以下主要抗体在4 ℃过夜进行免疫印迹检测：VEGF抗体(V抗体∶V抗体稀释液=1∶1 000)，Dll4抗体(V抗体∶V抗体稀释液=1∶1 000)，Notch-1抗体(V抗体∶V抗体稀释液=1∶1 000)和β-actin抗体(V抗体∶V抗体稀释液=1∶2 000).洗涤后，用HRP结合二级抗体(V抗体∶V抗体稀释液=1∶5 000)处理2 h，用ECL-Plus试剂盒进行观察.imagelab 3.0软件测量谱带强度.

1.3 统计方法

采用SPSS 19.0统计学软件统计分析，计量资料采用(均数±标准差)表示，各组间差异采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齐者两组间的差异比较用SNK-q检验，方差不齐者两组间的差异比较用Dunnett’s 检验法，P<0.05认为差异具有统计学意义.

2 结果

2.1 皮瓣成活率检测结果

第5、10、15、20天消肿组皮瓣成活情况显著高于模型组(P<0.05)，加入VEGF阻断剂后，消肿+AXI组皮瓣成活率下降(P<0.05)，当加入Notch阻断剂后，消肿+AXI组皮瓣成活率上升(P<0.05)(图1-2).

图1 20 d皮瓣透明硫酸纸准确描绘结果Fig.1 The results of 20 d skin flap with transparent sulfuric acid paper

2.2 VEGF免疫组织化学染色结果

第5、10、15、20天与假手术组相比，模型组皮瓣内的VEGF相对表达量显著增加(P<0.01).当加入消肿止痛合剂后，VFGF相对表达量进一步增加，且显著高于模型组，差异具有统计学意义(P<0.05).当加入VEGF阻断剂后，消肿止痛合剂引起的VEGF相对表达量增加的趋势被有效抑制，消肿+AXI组的VEGF相对表达量显著低于消肿组(P<0.05).当加入Notch阻断剂后，消肿止痛合剂引起VEGF增加的趋势更加明显(P<0.05)，以第15天增加最明显(图3-7).

1)与假手术组比较,P<0.05;2)与模型组比较，P<0.05;3)与消肿组比较，P<0.051)Compared with sham operation group, P<0.05; 2)Compared with model group, P<0.05; 3) Compared with detumescence group, P<0.05图2 皮瓣成活率结果Fig.2 Results of flap survival rate

图3 药物处理5 d后VEGF免疫组织化学染色结果Fig.3 Immunohistochemical staining results of VEGF after 5 days of drug treatment

图4 药物处理10 d后VEGF免疫组织化学染色结果Fig.4 Immunohistochemical staining results of VEGF after 10 days of drug treatment

图5 药物处理15 d后VEGF免疫组织化学染色结果Fig.5 Immunohistochemical staining results of VEGF after 15 days of drug treatment

图6 药物处理20 d后VEGF免疫组织化学染色结果Fig.6 Immunohistochemical staining results of VEGF after 20 days of drug treatment

1)与假手术组比较,P<0.05;2)与模型组比较，P<0.05;3)与消肿组比较，P<0.051) Compared with sham operation group, P<0.05; 2)Compared with model group, P<0.05; 3) Compared with detumescence group, P<0.05图7 不同时间点VEGF平均光密度值比较Fig.7 Comparison of VEGF mean optical density at different time points

2.3 VEGFA、Notch和Dll4 蛋白表达检测

与假手术组相比，模型组VEGFA、Notch、Dll4蛋白表达量显著增加(P<0.05)，当利用消肿止痛合剂处理后，VEGFA、Notch、Dll4 蛋白的表达量进一步增加，与模型组相比差异具有统计学意义(P<0.05).然而，当加入VEGF抑制剂后，消肿止痛合剂引起的VEGFA、Notch、Dll4 蛋白表达增加的趋势被显著抑制，差异具有统计学意义(P<0.05).当加入Notch抑制剂后，消肿止痛合剂引起VEGFA 表达增加，Notch、Dll4表达减少(P<0.05,图8).

1)与假手术组比较,P<0.05;2)与模型组比较，P<0.05;3)与消肿组比较，P<0.051) Compared with sham operation group, P<0.05; 2)Compared with model group, P<0.05; 3) Compared with detumescence group, P<0.05图8 药物处理后10 d皮瓣组织中VEGFA、Notch、和Dll4 蛋白表达结果Fig.8 Expression of VEGFA, notch and Dll4 protein in skin flap tissue after 10 days of drug treatment

3 讨论

术后远端组织缺血坏死是随机皮肤预后不良的重要原因.随机皮瓣在无特定血管的情况下，主要依靠新的毛细血管网灌注[4].由于没有特定血管的限制，导致皮瓣具有弹性，但也容易引起组织缺血坏死.术后血管生成从随意皮瓣的蒂部开始，向远端部位血管新生减少.因此组织缺血坏死多发生在远端，限制了随意皮瓣的长宽比(1.5～2.0∶1)，促进血管生成能够增加随机皮瓣的存活率[5].然而，一旦血管生成及随后的血液灌流，就会导致缺血再灌注损伤.缺血组织发生氧化应激，损伤随意皮瓣，并伴有细胞凋亡.因此，寻求更好的药物和方法，改善皮瓣血运状况[6]、尽快促进皮瓣血管再生是提高皮瓣成活率的重点.

消肿止痛合剂由川芎、三七、赤芍、生地、当归、青皮、桃仁、红花、木香、泽兰等组成,具有活血通络、消肿止痛之疗效.临床和实验研究发现，消肿止痛合剂能够减轻创伤后肢体肿胀消退及疼痛、促进瘀血吸收，降低炎症指标[1,7-8].川芎嗪对脑缺血/再灌注损伤等缺血性疾病患者有良好的治疗作用，具有抗氧化应激特性以及促进新生血管形成和减少细胞凋亡的能力，能促进穿支皮瓣的成活[9].红花苷增加了超氧化物歧化酶活性，降低了丙二醛水平，促进自由基清除，保护组织避免缺血再灌注的损伤[11].赤芍、桃仁和当归提取已被报道具有抗血栓的活性，能通过增加组织供氧、诱导抗炎作用和调节线粒体功能障碍来调节糖酵解、无氧和有氧代谢紊乱[11-12].

VEGF和Notch信号通路都是血管生成过程的关键调节因子.在生理和病理血管生成过程中，VEGF和Notch信号通路紧密协调构成芽的内皮细胞之间平衡尖端和茎细胞表型[13-14].VEGF-Dll4/Notch信号通路对血管再生调节的具体机制为：VEGFA通过与VEGFR2结合刺激并诱导内皮顶端细胞表达Dll4，Dll4与邻近柄细胞内的Notch信号结合，通过下调VEGFR2和上调VEGFR1的表达水平，抑制顶端细胞表型促进柄细胞特化，使二者之间保持在一个合适的比例以确保血管出芽的精确性.可见，VEGF是Dll4的正向调节因素，而Dll4是VEGF信号的负向调节因素.VEGF-Dll4/Notch信号通路在肿瘤血管再生及抗肿瘤药物治疗方面研究较多，但是在皮瓣血管再生方面却未见报道[15].

本研究着重研究消肿止痛合剂对VEGF-Dll4/Notch信号激活与血管新生的作用.皮瓣由于缺血缺氧的发生会导致血管内皮细胞的凋亡，造成不可逆的损伤，所以临床治疗中需要促进血管的新生，保护血管内皮细胞完整.本实验中造模后第5天模型组VEGF蛋白平均光密度值表达升高，第10天模型组仍呈高表达，第15天达到峰值，随后下降.分别对比消肿组与模型组、消肿+AXI组、消肿+MK组，VEGF表达在组别及时间主效应均存在统计学差异.说明消肿止痛合剂可显著提高皮瓣成活率，免疫组织化学染色显示增加了血管内皮生长因子(VEGF)的表达，由于VEGF是促进血管形成的起始关键细胞因子，激活Notch和Dll4信号，这样的作用无疑是血管形成的关键.VEGF阻断剂可引起VEGFA、Notch和Dll4蛋白表达增加的抑制，Notch信号阻断剂引起对Notch、Dll4 蛋白的抑制，VEGFA 蛋白表达继续增加.抑制Dll4/Notch信号转导可通过促进新生血管和血管生成，提高皮瓣成活率.

本研究提示，VEGF-Dll4/Notch信号通路在皮瓣再生中发挥着重要的作用，Notch阻断剂的应用促进了血管再生，这可能是Notch阻断剂增加了VEGF的水平，VEGF在早期对皮瓣再生意义重大.