羊毛角蛋白在巯基乙酸胆碱中的溶解再生

袁久刚， 季 吉， 薛 琪， 姜 哲， 范雪荣， 高卫东

(生态纺织教育部重点实验室(江南大学)， 江苏 无锡 214122)

羊毛是一种利用价值极高的天然角蛋白纤维,但是只有非常少量的细羊毛能用作纺织原材料，纺织行业每年都会产生数以万吨计的羊毛边角料，这不仅造成角蛋白资源的浪费，还给自然环境造成较大压力。作为一种性能高、来源广的可再生天然大分子，角蛋白具有良好的材料力学性能和生物相容性，在生物医用材料[1]、膜材料[2]、纤维材料[3]、可降解塑料和其他功能材料方面具有广泛应用。若能将羊毛溶解再生得到角蛋白，其附加值将得到大幅提升。

近几年，随着离子液体在纤维素溶解中的广泛应用，该体系也逐渐引起了角蛋白研究者的关注。在纤维素溶解中，离子液体的强极性可有效破坏大分子之间的氢键作用从而实现高分子聚合物的溶解[4-5]。对于角蛋白而言，其溶解则更具挑战性，因为角蛋白分子间不仅含有氢键，而且还含有大量的二硫键，这在一些研究中也得到了印证。例如：谢海波等[6]首先采用咪唑离子液体实现了羊毛的溶解和再生，但是要想达到较高溶解率必须采用非常高的溶解温度(130 ℃)以及较长的溶解时间(10 h)。之后，孙平等[7]研究了离子液体对鸡毛的溶解和再生，研究发现再生鸡毛角蛋白的β-折叠含量下降，同时溶解过程伴随少量二硫键的破坏，但是并未进行深入研究。本课题组研究[8]指出，这是由于高温导致的二硫键热裂解所致。孙艳丽等[9]采用巯基乙醇和离子液体混合体系对羊毛进行溶解，经过巯基乙醇还原后，离子液体的溶解效率大幅提高。这些研究都说明，只有有效破坏角蛋白的二硫键，离子液体在角蛋白中的溶解潜能才能得到进一步释放。

为此，本文选用一种新型的还原性离子液体——巯基乙酸胆碱对羊毛进行了溶解再生。巯基乙酸胆碱可以由巯基乙酸和氯化胆碱经简单的中和反应得到。本文首先采用偏光显微镜观察了单根羊毛纤维、皮质层和鳞片细胞在巯基乙酸胆碱中的溶解过程；继而对原羊毛和再生角蛋白的结构性能进行了详细分析，探究了羊毛在巯基乙酸胆碱中的溶解机制。

1 实验部分

1.1 主要原料与仪器

羊毛纤维，直径约为23 μm，无锡协新毛纺织股份有限公司；巯基乙酸胆碱，质量分数为95%，上海成捷离子液体有限公司。

XPV600E型电脑型偏光显微镜，上海比目仪器有限公司；NICOLET is10型傅里叶红外光谱仪，美国Thermo Fisher Scientific 公司； D2PHASER型X射线衍射仪，德国 Bruker 公司；Q200型差示扫描量热仪，美国TA公司；Mini-protean Tetro Cells 电泳系统，美国Bio-Rad伯乐公司。

1.2 羊毛预处理

称取适量羊毛置于索氏提取器中，用丙酮抽提脱脂，48 h后采用去离子水清洗羊毛，去除残存的丙酮，于60 ℃烘干后将羊毛纤维剪碎备用。

1.3 羊毛角蛋白提取

准确称取一定量的脱脂羊毛，将其置于20 g巯基乙酸胆碱中，于设定温度下磁力加热搅拌溶解一定时间，得到黄色混合液。待混合液冷却至室温后，向混合液加入适量8 mol/L尿素稀释，之后采用砂芯漏斗过滤，收集滤液后用透析袋(截留分子质量为8 000 u)透析，直至透析液电导率小于4 μS/cm时，完成透析，之后离心除去不溶性沉淀，将所获蛋白溶液冷冻干燥，得到再生角蛋白(可溶性部分)。

1.4 溶解观察

将单根羊毛纤维、皮质层和鳞片细胞分别置于盛有巯基乙酸胆碱的特制载玻片凹槽中，利用热台加热，用数码偏光显微镜观察其溶解过程，拍照记录。鳞片细胞及剥鳞方法参照文献[10]。

1.5 化学结构表征

使用傅里叶变换光谱仪对样品进行化学结构表征，采用KBr压片法分别测试原羊毛和再生羊毛角蛋白的红外光谱。扫描范围为4 000～600 cm-1，分辨率为0.4 cm-1，扫描次数为32。

1.6 结晶度测试

采用X射线衍射仪对样品进行结晶度测定，测试时取冷冻干燥后的样品平铺在晶片表面。测试条件：Cu靶，工作电压为30 kV，工作电流为10 mA，扫描范围为5°～50°，步长为0.02 (°)/min。

1.7 热力学性能测试

采用差示扫描量热仪对样品进行热力学性能分析。分别将干燥的原羊毛和再生羊毛角蛋白放入铝坩埚中，氮气气氛下进行测试，30 ℃下平衡5 min，测试温度为30～280 ℃，升温速率为10 ℃/min。

1.8 蛋白质分子质量测试

采用电泳系统，利用十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)方法对样品的分子质量进行测试，SDS-PAGE凝胶质量分数为12%，标准蛋白指示剂为10～270 ku。

2 结果与讨论

2.1 羊毛在巯基乙酸胆碱中的溶解速率

图1示出在120 ℃下不同时间羊毛在巯基乙酸胆碱中溶解质量分数。可以看出，巯基乙酸胆碱对羊毛的溶解性能非常高，在前100 min内，其溶解质量分数就能达到5%。随溶解时间逐渐增加，溶解羊毛后的巯基乙酸胆碱体系黏度也逐渐变大，因此对羊毛的溶解速度逐渐降低，当溶解时间为800 min时，其最高溶解质量分数接近16%。

2.2 溶解过程分析

图2示出在120 ℃ 条件下整根羊毛在巯基乙酸胆碱中的溶解过程。可看出，羊毛纤维在巯基乙酸胆碱中溶解时，首先发生鳞片层的溶胀(见图2(a)～(b))，随后是皮质层的溶胀(见图2(c))，进而巯基乙酸胆碱逐渐穿透进入羊毛内部，纤维晶区逐渐被破坏，变得透明，偏光慢慢消失，说明皮质层发生溶解(见图2(d))。整个过程鳞片层和皮质层的溶解同时发生，鳞片层首先被完全溶解，随后皮质层也被彻底溶解，羊毛结构完全消失，角蛋白溶出，视野呈现均一的透明体系(见图2(f))，溶解过程大约需要15 min。

图2 羊毛纤维在巯基乙酸胆碱中溶解过程

由于羊毛的鳞片层结构致密，富含二硫键，多数情况下，鳞片层对羊毛的溶解都会起到强烈的阻碍作用。为此，根据文献[10]的方法将鳞片与皮质层分离后分别研究鳞片层和皮质层在巯基乙酸胆碱中的溶解过程，结果如图3、4所示。

图3 皮质层在巯基乙酸胆碱中溶解过程

从图3可看出，鳞片剥除后的羊毛皮质层在溶解时不再发生明显的溶胀现象，随着溶解的进行，纤维直径逐渐变细，直至完全溶解消失。这表明巯基乙酸胆碱是皮质层的真溶剂，整个溶解由表及里进行，鳞片剥除后的皮质层溶解速度更快，整个溶解过程仅需要8～10 min。

图4 鳞片层在巯基乙酸胆碱中溶解过程

从图4可发现，随着溶解的进行，鳞片也出现了逐渐变小的现象(见图4(a)、(b))，溶胀不明显。这可能是由于采用甲酸剥除鳞片时，作用时间较长，甲酸对鳞片产生了一定的溶胀作用，并且巯基乙酸胆碱具有较强破坏二硫键的作用，导致鳞片结构也能够被快速溶解；此外，在鳞片溶解的同时，视野中出现了许多小气泡(见图4(c)～(e)中的黑点)，直至最后鳞片完全消失时，棕褐色气泡仍然存在。采用醋酸铅试纸检测时，试纸变黑，初步推测是由于二硫键断裂产生了硫化氢气体[11]。

综合图2～4可发现，鳞片存在时，单根羊毛纤维在溶解时存在明显的溶胀现象，而当鳞片剥除后，溶胀现象基本消失，皮质层的溶解速率明显加快，这说明鳞片对纤维的溶解起到了较强的阻碍作用。当鳞片覆盖在纤维表面的时候，部分巯基乙酸胆碱通过鳞片间隙渗透进入皮质层，导致皮质层蛋白发生快速溶解;但是由于鳞片的溶解速度较慢，因此，在外层鳞片的束缚下，最终出现了溶胀现象。

2.3 再生角蛋白化学结构分析

图5示出原羊毛和不同温度下再生角蛋白的红外光谱图。可看出，羊毛是典型的蛋白质纤维，其红外谱图中有4个典型的酰胺键吸收峰，酰胺A带(3 300～3 290 cm-1区域)、酰胺I带(1 650 cm-1处)、酰胺Ⅱ带(1 540～1 530 cm-1区域)以及酰胺Ⅲ带(1 243～1 237 cm-1区域)[12]。不同温度下溶解再生的角蛋白红外谱图与原羊毛非常相似，表明溶解过程中角蛋白的主链结构得到完好地保留。此外，再生角蛋白在1 058和980 cm-1处出现了较强的特征吸收峰。该处为S—O伸缩振动峰，这是由于溶解过程中，原羊毛中胱氨酸的二硫键被巯基乙酸胆碱还原形成了巯基，但是在高温条件下巯基又被空气中的氧气快速氧化，最终成为半胱氨酸氧化物。

图5 原羊毛及再生角蛋白红外光谱图

2.4 再生角蛋白结晶度分析

图6为原羊毛和再生角蛋白的X射线衍射谱图。可看到，羊毛及再生角蛋白均存在2θ在9°及20°附近的特征峰，其中，2θ=9°的峰主要由α-螺旋引起，2θ=20°附近的峰则主要由β-折叠引起。与原羊毛相比，再生角蛋白在2θ=9°附近特征峰强度明显下降，2θ=20°附近特征峰强度升高，说明溶解得到的可溶性再生角蛋白的α-螺旋结构减少，β-折叠结构增加。

图6 羊毛及再生角蛋白的X射线衍射图谱

为进一步说明角蛋白结晶度随溶解温度的变化，采用L-SEGAL建立的方法[13]，计算原羊毛与再生角蛋白的结晶指数CI，结果见表1。计算公式为

CI=(I9-I14)/I9

式中：I9为2θ等于9°处最强衍射峰强度；I14为2θ等于14°处最小衍射峰强度。

表1 羊毛及再生角蛋白结晶指数

由表1可看出，相较于原羊毛，可溶性再生角蛋白结晶指数降低较多。随着溶解温度的增加，结晶指数逐渐下降，其原因可能是高温条件下角蛋白大分子发生了一定程度的降解，以及一部分非可溶性大分子角蛋白在透析时被去除，从而引起结晶度下降。

2.5 再生角蛋白热性能分析

分别对原羊毛和不同温度下再生角蛋白进行差示扫描量热分析，结果如图7所示。

图7 再生角蛋白差示扫描量热图

由图7可看出，原羊毛和再生角蛋白都有2个明显的吸热峰。一个是介于125～155 ℃的结合水吸热峰；另一个是200～250 ℃附近的α-螺旋解折叠和基质胱氨酸分解双吸热峰[14-18]。再生角蛋白的结合水吸热峰后移，这是因为溶解再生后，通过透析主要得到的是一些可溶性角蛋白，其亲水性增加，氢键结合能提高所致。200～250 ℃附近的双吸热峰随着溶解温度的提高，吸热峰面积越低，这说明羊毛在巯基乙酸胆碱溶解时，其α-螺旋结构被破坏，再生后角蛋白中的α-螺旋结构无法恢复。

2.6 再生角蛋白的分子质量分析

图8示出原羊毛和再生角蛋白的电泳分析结果。可看到，原羊毛角蛋白在10～160 ku 的分子质量范围均有分布。相较于原羊毛，再生角蛋白分子质量发生了不同程度的降低。再生角蛋白分子质量大部分集中在10～40 ku之间，在大于40 ku区域内，b组条带最深，其次是c组，d组几乎无条带出现。这说明溶解过程伴随着角蛋白大分子的降解，同时由于一部分非可溶性大分子角蛋白在透析时被去除，导致产物的分子质量下降。并且溶解温度对再生角蛋白分子质量影响较大，温度越高，再生角蛋白分子质量越低。

a—标准蛋白；b—再生角蛋白(110 ℃)； c—再生角蛋白(120 ℃)；d—再生角蛋白(130 ℃)；e—原羊毛。

3 结 论

巯基乙酸胆碱是羊毛的优良溶剂，能够高效还原二硫键，对阻碍溶解的致密鳞片层有较强的破坏作用，因此可以快速溶解羊毛纤维。经巯基乙酸胆碱溶解再生的角蛋白保留了完整的蛋白质大分子主链结构，分子质量介于10～40 ku之间，但结晶度和α-螺旋结构含量都有所降低，长时间的高温溶解也会导致蛋白大分子降解;因此在利用巯基乙酸胆碱溶解角蛋白的过程中需要严格控制溶解温度和溶解时间。