MMP-3与MMP-13在幽门螺杆菌相关胃炎中的表达及其临床意义

宋世磊，丁光伟，闫方博，万磊

（河南科技大学附属许昌市中心医院1.消化内科；2.胃镜室；3.病理科，河南 许昌 461000）

慢性胃炎是一种常见的由各种原因引起的慢性胃粘膜炎性疾病，其发病率在各种胃疾病中居首[1]。慢性胃炎的发病机制目前尚不清楚，但是诸多影响因素如：生活习惯、遗传和传染性因素（幽门螺杆菌）均可导致患慢性胃炎的风险增加[2]。人基质金属肽酶13（MMP-13）是一种蛋白水解酶，由Freij及其团队在1994发现[3]。在慢性炎症引起的头颈部鳞状癌，软骨肉瘤，膀胱移行细胞癌和口腔粘膜癌中检测到MMP-13的表达[4]。有研究结果表明，在几百例癌症患者中，约有21%的患者表达了MMP-13 mRNA，在诊断时所有浆膜浸润的肿瘤均显示高水平的MMP-13 mRNA，表明MMP-13的表达在组织炎症发展过程中具有至关重要的作用[5]。人基质金属肽酶3（MMP-3）是基质金属肽酶家族中的一员，有研究发现，对幽门螺杆菌感染者使用药物进行治疗后，在患者病情恢复的同时，其血清MMP-3表达水平也随之降低[6]。同时国外研究报道，MMP-3表达量的增加可激活MMP-13上游靶基因，从而促进MMP-13的表达[7]。幽门螺杆菌感染与慢性胃炎的发生密切相关，幽门螺杆菌诱导溃疡和胃炎中TNF-α和IL-1β的分泌，从而刺激胃上皮细胞中MMP-3和MMP-13的分泌，因此，胃细胞可能会受到幽门螺杆菌定植的影响，从而促进炎症并损害胃粘膜[8]。因此本研究以102例慢性胃炎患者为研究对象，探讨MMP-3和MMP-13表达水平与幽门螺杆菌相关胃炎的关系，为临床幽门螺杆菌相关胃炎的治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取我院消化科自2019年1月至2020年1月确诊的102例慢性胃炎患者作为研究对象，纳入标准：⑴参照《中国慢性胃炎共识意见（2017，上海）》[9]，胃镜和病理组织切片活检确诊为慢性胃炎；⑵所选患者具有完整的临床基础资料。排出标准：⑴患者年龄小于18岁；⑵妊娠或哺乳期妇女；⑶近一个月内服用过抗幽门螺杆菌类药物；⑷合并患有其他严重胃部疾病；⑸患者存在严重精神障碍，无法正常沟通交流。根据14C尿素呼气试验结果，将102例慢性胃炎患者分为幽门螺杆菌（H.pylori）阳性组和阴性组，其中H.pylori阳性组59例，H.pylori阴性组43例。本研究已取得患者本人及家属知情同意，且通过我院医学伦理委员会审批。

1.2 主要试剂 MMP-3（批号：201549）、MMP-13蛋白抗体（批号：201544）购自武汉Elabscience公司；山羊抗兔二抗（批号：SW201948）购自上海宝生物有限公司；DAB显色试剂盒（批号：a847910）购自北京万泰德瑞诊断技术有限公司；进口山羊血清（批号：414587）购自鼎国生物有限公司。

1.3 H-E染色 将组织蜡块切成5μm，置于防脱载玻片上，经脱蜡（二甲苯）、水化（梯度乙醇）处理，苏木素和伊红染色2 min,水洗后脱水，中性树脂封片，显微镜下观察。

1.4 免疫组织化学法 将组织蜡块切成5μm，置于防脱载玻片上，经脱蜡（二甲苯）、水化（梯度乙醇）处理后进行如下步骤：⑴PBS溶液浸泡3次，每次5 min，晾干；⑵将切片置于枸橼酸钠缓冲液中煮沸15 min进行抗原修复，PBS浸泡3次，每次5 min；⑶3%双氧水浸泡10 min,用于去除内源性酶，PBS浸泡3次，每次5 min；⑷每张切片的组织上滴加50μl山羊血清，封闭30 min；⑸弃去山羊血清，不用清洗，加50μl一抗孵育，4℃过夜；⑹次日，弃去一抗，PBS浸泡3次，每次5 min，晾干，滴加50μl二抗（生物素标记的羊抗兔IgG）孵育30 min；⑺弃去二抗，PBS浸泡3次，每次5 min，滴加DAB显色剂，镜下观察组织颜色，适时终止；⑻PBS洗去DAB显色剂，滴加苏木素复染约5 min，自来水冲洗，1%的盐酸酒精（75%）溶液分化5s，自来水冲洗5 min蓝化；⑼依次经过70%、80%、90%、95%、无水乙醇各5 min，二甲苯20 min后用中性树脂封片。显微镜下观察MMP-3、MMP-13蛋白表达水平。

1.5 免疫组化结果判定 采用双盲法，由两位未参与前期试验且有病理工作经验的工作人员在（×100）视野下对蛋白表达结果进行统计。采用半定量分析法进行统计，具体计分方法如：⑴阳性细胞表达率：0分=无表达、1分=1%～25%、2分=25%～50%、3分=50%～75%、4分=75%以上；⑵染色强度：0分=无颜色、1分=浅黄色、2分=黄色、3分=棕黄色。两者得分相乘作为最后得分，≥2分为表达阳性，＜2分则为阴性。

1.6 统计学方法 采用SPSS23.0软件统计分析数据，符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用两独立样本t检验；计数资料以例频数/百分率（%）表示，组间比较采用χ2检验，危险因素分析采用Logistic回归分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料比较 102例慢性胃炎患者中H.pylori阴性组43例（42.16%）,其中男性25例（58.14%）,女性18例（41.86%），年龄23～65，平均年龄（41.15±7.07）岁；H.pylori阳性组59例（57.84%），其中男性37例（62.71%），女性22例（37.29%），年龄24～67岁，平均年龄（41.51±7.11）岁，H.pylori阴性和H.pylori阳性患者性别构成比和年龄差异均无统计学意义（P＜0.05）。

2.2 HE染色结果 有病理结果可以发现，H.pylori阴性组患者胃粘膜有少量炎性细胞浸润，同时伴有少量淋巴细胞和浆细胞浸润；而H.pylori阳性组患者胃粘膜大部分肠化生，固有腺体减少，同时组织结构大量被破坏，并伴有较多炎性细胞浸润，见图1。

图1 两组患者胃组织病理镜下表现（苏木素-伊红染色，×40）

2.3 两组患者MMP-3、MMP-13蛋白表达水平比较 两种蛋白的表达均位于细胞核内，与H.pylori阴性组比较，H.pylori阳性组MMP-3和MMP-13蛋白表达水平均显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1和图2。

图2 两组患者胃组织镜下MMP-3、MMP-13蛋白表达水平（免疫组织化学，×200）

表1 两组患者MMP-3、MMP-13蛋白表达水平比较[n（%）]

2.4 MMP-3、MMP-13表达水平与患者基础指标的关系 通过比较不同年龄、性别、吸烟史和饮酒史患者发现，其胃组织中MMP-3、MMP-13表达水平均无显著性差异（P＞0.05），见表2。

表2 胃组织中MMP-3、MMP-13蛋白表达情况和临床基础指标的关系[n（%）]

3 讨论

胃炎是临床上常见的消化道疾病，根据病理和病程特点，胃炎常分为急性胃炎和慢性胃炎两大类。其中慢性胃炎的发生率较高，治疗药物种类繁多，但治疗效果较差，很容易复发[10]。慢性胃炎的病因和机制非常复杂，通常是由多种因素引起的，其中氧自由基破坏胃粘膜的假设已逐渐为人们所接受。氧自由基是重要的致病因子，主要通过脂质过氧化和共价键结合引起胃粘膜损伤[11]。胃粘膜损伤是由于胃粘膜防御功能和损伤因子之间的平衡被破坏，最终导致胃的急慢性炎症性损伤[12]。研究证实，慢性胃炎患者更容易患胃癌。此外，慢性胃炎的炎症活动期被认为是浸润性胃癌癌前病变的第一阶段。因此，为了预防疾病的发展，慢性胃炎应引起足够的重视并得到治疗[13]。幽门螺杆菌诱发慢性胃炎的发病机理尚不清楚，但是在幽门螺杆菌的目前已知研究中发现，可产生多种毒力因子。有研究显示，在小鼠感染幽门螺杆菌后，其胃粘膜发生不典型增生和萎缩的时间明显早于无幽门螺杆菌感染的小鼠，说明幽门螺杆菌感染可加重慢性胃炎的病情[14]。

基质金属蛋白酶（MMP）通过调节细胞的生长,分化,凋亡,侵袭,转移，血管生成和免疫监视，在疾病发展的多个步骤中起重要作用[15]。目前MMPs家族成员已鉴别出MMP1～26共计26种，根据其同源性，可分为胶原酶、明胶酶、基质降解素和基质溶解素等6大类，其中已被证实MMP-3可激活MMPs家族其他成员。MMP-3为一种基质溶解素，其作用是分解细胞外基质，从而导致外界环境中的病原菌更容易进入细胞内部，从而加速疾病的发生发展[16]。MMP-13，也称为人胶原酶-3，被认为在多种炎性疾病的发展过程中起重要作用。有研究发现，在早期骨关节炎中，MMP-13的表达和含量均显著上升,且随着疾病的进程呈现上升趋势[17]。但是目前关于MMP-3与MMP-13蛋白在慢性胃炎中的研究还鲜有报道，但是同作为MMPs家族中的一员，其表达也存在一定的关联性。在正常细胞中，MMP-13的表达水平一般相对较低，但是有研究发现，在关节炎等疾病中，MMP-3蛋白表达水平的增加，可促进MMP-13蛋白的高表达，从而引起疾病向不利于转归的方向发展[18]。

在本研究中，与未感染幽门螺杆菌的胃炎患者相比，感染幽门螺杆菌的胃炎患者胃粘膜大部分肠化生，固有腺体减少，同时组织结构大量被破坏，并伴有较多炎性细胞浸润，表明较普通胃炎患者，在感染幽门螺杆菌后，其对患者机体损伤更加严重。对比H.pylori阴性组和阳性组发现，H.pylori阳性组MMP-3与MMP-13蛋白表达水平均显著高于H.pylori阴性组，结合病理结果，进一步反应了幽门螺杆菌对机体的损伤严重程度，其机制可能是幽门螺杆菌通过产生某些毒力因子，从而促进机体MMP-3的蛋白表达增加，同时MMP-3靶向调控MMP-13蛋白表达水平，是MMP-13表达水平增加，MMP-3与MMP-13蛋白表达增加后，促进机体炎症水平的加重，从而使疾病向不利于转归的方向发展。同时本研究也分析了不同年龄、性别、吸烟和饮酒史患者的MMP-3与MMP-13蛋白表达水平，结果显示MMP-3与MMP-13蛋白表达水平与患者年龄、性别及生活习惯并无相关性，因此也可更进一步的说明MMP-3和MMP-13蛋白的表达水平可能是受到了幽门螺杆菌的影响。

综上，MMP-3与MMP-13可能参与了幽门螺杆菌致炎过程，幽门螺杆菌可能导致了其异常表达，从而促进了胃粘膜上皮细胞增殖紊乱的发生，使患者炎症加重，这可能是幽门螺杆菌治病的可能机制之一，有望为临床幽门螺杆菌引起的慢性胃炎提供治疗靶点。