黑豆皮对铅中毒导致果蝇机体损伤的影响研究

李飞翔, 刘志华, 肖桂然

(合肥工业大学 食品与生物工程学院,安徽 合肥 230601)

铅是一种环境持久性毒素、会引起神经、血液、胃肠道、生殖、循环和免疫病理学等障碍[1]。多项研究表明,铅具有催化氧化反应并产生活性氧的倾向,这些活性氧会造成机体氧化损伤[2-4]。越来越多的流行病学研究证据表明,铅暴露与铁缺乏症密切相关[5-6]。前期实验表明,铅暴露会导致果蝇全身铁含量降低并造成果蝇一系列的生理缺陷,食物中加铁会显著地挽救铅毒性造成的表型[7]。

铁是人体中最丰富的微量元素,是许多蛋白质合成所必需的[8-9]。铁稳态异常会导致许多人类疾病[10]。中医药是我国传统文化的瑰宝,在治疗各种疾病方面有着悠久的历史,为了中华民族的健康做出了巨大的贡献。我国自古以来都有“药食同源”的理论,黑色食品有补血补气的功效,在治疗缺铁性贫血方面有着一定的临床效果[11]。

黑豆是一种营养丰富的食物。根据《中国药典》记载,黑豆具有补血补肾的功效[12]。中医历来认为黑豆具有健脾利水、滋阴润肺、活血解毒等功效[13]。现代研究表明,黑豆的种皮由于含有丰富的花青素,具有多种有益的生物活性[14],例如抗氧化作用、抗糖尿病以及抗肥胖等功效[15-17]。还有研究表明，黑豆皮(black soybean seed coat,BSSC)的提取物能调控机体铁代谢[18]。

本文以经典模式生物果蝇研究表明,膳食摄入BSSC能显著挽救果蝇铅中毒的表型,包括存活率、生长周期、行动能力以及寿命。进一步研究表明,膳食摄入BSSC能显著挽救铅中毒导致的果蝇体内铁缺乏。本研究推测,膳食摄入BSSC能够通过促进铁吸收缓解铅中毒，能够为铅中毒的防治提供新的线索。

1 材料与方法

1.1 材料

果蝇饲养在标准的玉米面粉培养基上,饲养环境为25 ℃、65%湿度。添加黑豆皮粉的质量浓度为20 mg/mL,添加乙酸铅浓度为1 mmol/L,果蝇基因型为W1118，来自维也纳果蝇资源中心。

1.2 方法

1.2.1 存活率的测定

将新羽化的野生型W1118蝇交配3 d,然后将它们转移到琼脂平板上并产卵24 h。 新孵化的第1龄幼虫被转移到不同种类的食物中。 密度控制为每管50只幼虫,每组10管,统计羽化果蝇的数目。存活率计算公式为:

(羽化的果蝇数/50)×100%。

1.2.2 行动能力的测定

在各食物处理组中,每组在一根20 cm长的空管中挑入20只果蝇,将所有果蝇磕入底部,计时5 s,统计果蝇能爬过10 cm高的数量。

1.2.3 果蝇寿命的测定

在各食物处理组中,每组放入20只同一天羽化的雌蝇,每2 d更换培养基,剔除死亡果蝇并计数,至各组果蝇全部死亡,29 ℃,65%湿度,每组10管。

1.2.4 铁相对含量的测定

采用菲洛嗪比色法测定果蝇幼虫铁。简而言之,用PBST(137 mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、10 mmol/L Na2HPO4、2 mmol/L KH2PO4和0.1%Triton X-100,pH值7.4)提取组织样品；通过BCA蛋白质测定试剂盒测量蛋白质浓度，将蛋白质样品在95 ℃下用浓盐酸水解20 min,并在16 000g下离心；用75 mmol/L抗坏血酸将上清三价铁还原为亚铁，添加菲洛嗪,涡旋并瞬时离心；最后,将饱和乙酸铵添加到每个管中,并在562 nm处测量吸光度。

1.2.5 数据统计与分析

实验数据采用SPSS16.0软件处理,实验结果表示为(均值±标准差),组间差异使用One-way ANOVA检验,显著性水平P<0.05(*),P<0.01(**),P<0.001(***)。

2 结果与分析

2.1 黑豆皮挽救铅暴露果蝇的存活率

铅暴露的果蝇存活率的检测结果如图1所示。图1中，NF表示正常食物;BSSC表示黑豆皮;Pb表示乙酸铅，下同。由图1可知,与正常食物组相比,铅暴露组果蝇的存活率显著降低,是对照组的40%,但是黑豆皮粉处理组存活率与铅暴露组相比得到显著的挽救,约为正常组的60%。

图1 不同食物处理组果蝇存活率

2.2 黑豆皮挽救铅暴露果蝇生长周期

一般饲养环境下正常食物果蝇从幼虫到羽化生长周期约为10 d,铅暴露果蝇生长迟缓,结果如图2所示。由图2可知, 铅暴露组果蝇生长周期与正常食物组相比变得延长,比正常组多1.5 d,而黑豆皮粉处理组果蝇生长周期与正常组相同。说明黑豆皮能挽救铅所造成的果蝇生长迟缓。

图2 不同食物处理组果蝇生长周期

2.3 黑豆皮挽救铅暴露果蝇行动能力

检测铅暴露条件下果蝇的行动能力如图3所示,由图3可知,铅暴露组的果蝇行动能力降低,约为正常食物组的70%,但是当黑豆皮同时干预之后果蝇的行动能力恢复到正常组的90%。

组别

2.4 黑豆皮挽救铅暴露果蝇寿命

为了检测不同食物组对果蝇寿命的影响,本文选用同一天不同食物上羽化的雌蝇,在29 ℃的培养箱中饲养,记录每天死亡数目，如图4所示。

图4 不同食物上果蝇的寿命

由图4可知,在铅暴露食物组果蝇在20 d时已经大部分死亡,死亡率50%时铅暴露组中期寿命为16 d,而添加黑豆皮后挽救到22 d。

2.5 黑豆皮摄入提高果蝇体内铁相对含量

为了进一步探讨铅暴露与果蝇机体铁代谢的关系,本文采用菲洛嗪法测定不同食物上的果蝇三龄幼虫总铁相对含量,如图5所示。由图5可知，在铅暴露组果蝇铁相对含量与正常组相比显著降低,约为正常组的50%,而黑豆皮干预组铁相对含量与铅暴露组相比显著升高,约为正常组的75%；单独添加黑豆皮组铁相对含量与正常食物组相比也有所升高,约为正常组的125%。说明黑豆皮本身具有补铁的作用。

图5 不同食物组果蝇全虫铁相对含量

3 结 论

本文以果蝇为模式生物,探究了铅暴露在果蝇体内的危害以及黑豆皮对铅暴露果蝇的挽救。结果表明，铅暴露使果蝇存活率降低、发育迟缓、行动能力下降以及寿命缩短,而黑豆皮能有效地挽救这些表型；当检测果蝇身体铁相对含量时,铅暴露会导致果蝇身体铁相对含量降低,而添加黑豆皮能升高果蝇铁相对含量。因此推测黑豆皮能够提高果蝇机体铁水平进而挽救铅中毒。