RACK1在子宫颈癌中的表达及临床意义

袁浩鑫，邢利青，卢 烨，范清娥

（1.大同市第五人民医院，山西大同 037000；2.山西大同大学第一临床医院，山西大同 037009）

子宫颈癌（cervical cancer）是来源于子宫颈上皮的恶性肿瘤，主要组织学类型是鳞癌,腺癌次之[1]。在世界范围内,子宫颈癌是女性发病第4 位的恶性肿瘤。生活在较不发达地区的妇女,子宫颈癌是继乳腺癌之后的第2 大常见妇女恶性肿瘤,占全球新发病例的84%，其病死率在所有女性恶性肿瘤中居于第2 位[2]。近年来该病发病率呈上升趋势且年轻化[3-4]。子宫颈癌的发生发展严重影响患者的身体健康和生活状况[5]。探索表达异常的生物学标志物,为早发现、早诊断、早治疗宫颈癌提供新的思路具有重要意义。激活的蛋白激酶C 受体1（receptor for activated C kinase 1，RACK1）蛋白是一种高度保守的细胞内接头蛋白,是一种锚定蛋白,可参与细胞内多种信号传导通路,进而影响细胞的生长、迁移和分化等过程,与肿瘤的发生和进展有关[6-8]。RACK1 在多种恶性肿瘤中阳性表达较高，但其在子宫颈癌中的表达研究较少。本研究采用免疫组化两步法及RT-PCR（反转录酶聚合酶连锁反应）测定RACK1 在宫颈癌组及癌旁组的表达，旨在探讨RACK1 在宫颈癌中的表达情况，探讨其在宫颈癌中的作用，为宫颈癌的早期诊断和治疗带来新的契机。

1 资料

选取大同市第五人民医院2015 年1 月-2018 年12 月收治的经腹腔镜或开腹手术治疗且病理学检查确诊为子宫颈癌的组织标本100例作为宫颈癌组，同时取距宫颈癌组织3 cm 以上的宫颈组织作为癌旁组60 例。病例年龄在32～69 岁之间，平均49±7 岁。病理类型：鳞癌67例（其中特殊类型隆起型中分化鳞癌2 例、非角化型鳞状上皮癌1 例），腺癌33 例（其中特殊类型宫颈基底细胞样腺癌1例）。采用国际妇产科联盟（FIGO，2009 年）的标准对实验组进行临床分期：Ⅰ期22 例，Ⅱ期40 例，Ⅲ期27 例，Ⅳ期11 例。分化程度：高31例，中41例，低28例。有淋巴结转移26例,无淋巴结转移74 例。纳入标准：①符合宫颈癌临床诊断且均经手术治疗者；②病理学检查最终确诊为子宫颈癌的病例；③临床资料完整，辅助检查完善；④手术前未经过化疗、放疗及免疫治疗。排除标准：①转移性子宫颈癌；②年龄较大，且合并严重的心脑血管疾病及精神疾病等系统性疾病无法耐受手术者；③合并其它生殖系统恶性肿瘤者；④患有其它系统恶性肿瘤者；⑤临床资料不完整，缺失，难以进行统计分析及缺少病理标本者。本研究获得我院医学伦理委员会批准同意，所有参与者均知情同意并签署知情同意书。

2 方法

2.1 免疫组织化学染色

2.1.1 方法（En Vision 两步法）

将各组织石蜡包块切成5 μm 厚度的石蜡切片，常规脱蜡，免疫组化采用En Vision 两步法，DAB 显色。PBS缓冲液代替一抗为阴性对照，已知阳性切片做阳性对照，具体染色步骤严格按照试剂盒说明书进行操作。检测试剂盒、一抗RACK1 均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

2.1.2 结果判读

RACK1 蛋白阳性染色定位于细胞质和细胞核，着色呈浅黄色、黄色、棕黄色和黄褐色。取有代表性的10 个高倍视野在高倍镜（×400）下观察计数，根据着色强度和阳性细胞所占比例进行评分。着色强度：淡棕色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，黄褐色为3 分。阳性细胞所占比例，按百分比计数：1 分（＜25%），2 分（25%～50%)，3 分（＞50%～75%)，4分（＞75%）。每张切片染色阳性细胞占比评分×每张切片染色强度评分得出的结果，即为免疫组化反应评分，＜4分为阴性，≥4分为阳性。

2.2 反转录酶聚合酶连锁反应RT-PCR

用Oligo6 软件进行RACK1 引物设计，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。用Trizol 试剂提取宫颈癌组织及宫颈癌旁组织总RNA，并用核酸测定仪测定RNA 含量，取2 μg 按反转录试剂盒说明书将RNA 逆转录获得cDNA，用合成的cDNA 为模板，用PCR 仪分别进行扩增RACK1 mRNA 以及内参基因GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)，其中GAPDH上游引物序列为5′-AGTCTTGCTAGCTACGCG CCT-3′，下游引物序列为5′-CGCTAAAGCTAG CTACGCATCGA-3′，产物长度为195 bp。RACK1上游引物序列为5′-TAGCGGCTAACGTTTACGC C-3′，下游引物序列为5′-AGGCTGCTAGCTAAC CGTCAA-3′，产物长度为324 bp。循环条件为：90 ℃预变性10 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共计40个循环，72 ℃终延伸10 min，12 ℃保存。PCR 结束后，各取5μL 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行分离，后经溴化乙锭染色，采用电泳凝胶成像分析系统测定RACK1/GAPDH 的灰度比，作为RACK1mRNA相对表达量。

2.3 统计学处理

所有数据至少重复3 次，采用SPSSl8.0 统计软件进行实验数据分析。计数资料组间比较采用χ2检验，计量资料数据用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 RACK1蛋白阳性表达率

宫颈癌组RACK1蛋白阳性表达率为66.00%（66/100），高于宫颈癌旁组阳性表达率8.33%(5/60)，2 组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

3.2 宫颈癌组与宫颈癌旁组中RACK1 蛋白表达情况比较

RACK1 蛋白在低分化宫颈癌组织中的表达率高于高、中分化者,在有淋巴结转移的宫颈癌组织中的表达率高于无淋巴结转移者（P＜0.05）,而在国际妇产科联盟（FIGO，2009年）临床分期、浸润深度及不同病灶直径宫颈癌组织中的RACK1蛋白阳性表达率差异无统计学意义（P＞0.05）。详见表1。

表1 宫颈癌组中RACK1蛋白表达差异

3.3 反转录酶聚合酶连锁反应（RT-PCR 法）测定RACK1 mRNA相对表达量

用RT-PCR 法检测结果显示，宫颈癌组RACK1 mRNA相对表达量平均值（0.798±0.124）高于宫颈癌旁组平均值（0.269±0.076），差异有统计学意义（t=33.479，P=0.000）。反应产物条带见图1。

4 讨论

宫颈癌的恶性程度及对女性身体健康的危害不容置疑。目前已知13～15 种HPV 与子宫颈鳞状上皮内病变和子宫颈癌发病密切相关[1]。在发达国家已建立完善的宫颈癌疫苗接种体系。目前，二价、四价、九价宫颈癌疫苗已在我国获得批准使用，但疫苗不能覆盖所有致病的HPV 型别。早发现、早诊断、早治疗子宫颈癌，对于女性身体健康仍至关重要。RACK1 分子是一种锚定蛋白，可以调控多条信号通路，引发信号分子形成复合物，从而调控基因表达，参与多种恶性肿瘤的发生发展。既往研究发现，RACKl 在乳腺癌、肝癌、食管癌、结肠癌、卵巢癌和肺癌等多种恶性肿瘤中表达呈阳性且升高[9-12]。本研究结果显示RACK1蛋白在宫颈癌组阳性表达率高于宫颈癌旁组；在低分化宫颈癌组织中的表达率高于高、中分化者，在有淋巴结转移的宫颈癌组织中的表达率高于无淋巴结转移者。而在FIGO 分期、浸润深度及不同病灶直径方面无明显差异。

综上所述，RACK1 在宫颈癌组织中阳性表达较高，且其表达与肿瘤的分化程度及淋巴结转移有关，可能与宫颈癌的发生与发展密切相关，随着进一步的研究与探索，RACK1 有可能会作为评估子宫颈恶性病变生物学行为的潜在分子标志物，为早发现、早诊断宫颈癌提供理论依据。针对RACK1靶基因的治疗，可能会成为宫颈癌治疗的一种全新而有效的方法，可为宫颈癌的治疗提供新的思路，为以后进一步的研究和更好的指导临床工作打下基础。