有氧运动对2型糖尿病大鼠肾脏的保护作用

2021-04-06龚云，李敏

中国体育科技 2021年2期

龚云，李敏

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病主要微血管并发症之一，在糖尿病患者中发病率为20%～40%，病变主要累及肾脏小血管和肾小球，引起蛋白尿排泄和滤过异常（许曼音，2012）。目前研究认为，其发病机制可能与遗传易感性、糖脂代谢紊乱及肾小球血流动力学改变等因素有关。这些因素长期存在可导致肾小球系膜基质及基底膜合成增加、降解减少，最终导致肾小球硬化（许曼音，2012）。孟瑞（2008）的研究发现，胰岛素抵抗大鼠肾小球、肾小管、足细胞等多部位形态结构发生改变，且这些变化出现早于糖尿病临床症状。刘曦等（2017）的研究显示，姜黄素类似物L6H4可能通过下调TGF-β1的表达来抑制FN、Col-IV的大量分泌，减轻细胞外基质的沉积，从而起到保护2型糖尿病大鼠肾脏的作用。但鲜见有氧运动对糖尿病大鼠糖代谢、肾脏显微结构及功能影响的相关研究。本研究通过8周有氧跑台运动，观察糖尿病大鼠糖代谢、肾脏显微结构与功能的变化，并探讨早期有氧运动干预对2型糖尿病大鼠肾脏的保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验对象

选取8周龄健康雄性Wistar大鼠[购自兰州大学实验动物中心，SPF 级，SCXK（甘）2010-0001、SYXK（甘）2010-0002]40只，体质量185～220 g，SPF级维持饲料喂养、自由饮食。动物室温度22℃～23℃，相对湿度38%～42%，自然通风、光照，每周紫外线消毒1次饲养室和用具。

1.2 建模、分组及运动

所有大鼠适应性喂养1周后，随机选取10只作为对照组（NC组，普通饲料喂养、自由饮水）。其余大鼠以高脂、高糖饲料（10%蔗糖、10%猪油、5%胆固醇）喂养4周，期间正常饮水，第30天（前1天禁食12～16 h，不禁水）按30 mg/kg体质量逐只腹腔注射STZ（链尿佐菌素，购自sigma公司，用1%枸橼酸钠缓冲液，pH 4.2），48 h后，连续3天同一时间取血测血糖，若血糖≥16.67 mmol/L且出现“三多一少”体征，即可判为建模成功，成功率约为70%（Matteucci et al.，2008）。NC组大鼠注射等量的枸橼酸钠缓冲液。将建模成功的大鼠随机分为两组：糖尿病组（DM，8只）和糖尿病运动组（DS，8只）。参考Bedford等（1979）的方法，DS组大鼠先行3天适应性跑台（DSPT-202，中国杭州钱江科工贸公司制造）运动，强度从15 m/min（15 min，0°）开始，逐渐增加到 25 m/min（30 min，0°）（赵杰修等，2007），连续运动8周，1次/天，逢周日休息1天。NC组、DM组大鼠不运动，笼内自由活动。期间观察各组大鼠饮食、尿量及精神状态等。

常用的糖尿病动物模型的建造方法有手术法和实验法两种，前者行外科手术切除胰腺后成模，后者多用四氧嘧啶或链脲佐菌素（STZ）腹腔注射成模。其中STZ对β细胞有毒性作用，可使β细胞变性、坏死，因其毒性较小、比较稳定而多被选用。2型糖尿病属非胰岛素依赖型糖尿病，即胰岛素分泌相对不足，其发病机理存在两方面因素：胰岛素抵抗和β细胞分泌功能障碍。在2型糖尿病大鼠模型具体建造方法上，因成年、雄性成模率高多被选用，通常采用高脂、高糖饲料喂养1月余以诱发胰岛素抵抗，并佐以小剂量单次STZ腹腔注射而成模，整个过程与人类2型糖尿病发病过程极为相似。国内外学者多采用血糖≥16.67 mmol/L为建模成功的判定标准（Matteucci et al.，2008），这有别于部分学者采用血糖≥11.1 mmol/L或≥13.8 mmol/L的判定标准。在STZ注射剂量选择上，常以50 mg/kg为中等剂量判定标准，大于或小于该值均会对模型产生不同影响。模型建立的成功与否是决定实验成败的关键环节。本实验选用Wistar成年雄性大鼠建模，以高脂、高糖饲料连续喂养4周，单次小剂量腹腔注射STZ（30 mg/kg），以血糖≥16.67 mmol/L为成模判定标准，所以本实验建造的2型糖尿病大鼠模型在质量控制上是科学的、可靠的。

1.3 取材及指标测试

在实验前、后分别逐只准确测量各组大鼠体质量（清晨空腹）。实验结束时，将各组大鼠逐一腹腔注射0.4%戊巴比妥钠麻醉，真空管心尖取血测血糖（FBG，美国会好血糖仪）、血清胰岛素（Ins，放射免疫法，GC-911放射免疫γ计数器，科大创新有限公司中佳分公司）及糖化血清蛋白（GSP，比色法）含量；采用Microlab zoo（荷兰威图）半自动生化分析仪测血肌酐（Scr）、血尿素氮（BUN）及尿酸（UA）值，后置于冰盘上迅速取左侧肾脏，滤纸拭干血渍后用镊子去除肾包膜，并分离其皮质，纵切左肾一半置于10%福尔马林浸泡过夜，组织切片备用。

1.4 制片、观察及数据处理

随机切取各组大鼠左肾5 mm3皮质2块，脱水后行常规石蜡包埋并切片（组织切片机，德国徕卡仪器有限公司），隔2选1脱蜡、H.E.染色，中性树胶封片，每组制片10张，用Motic数码显微镜（BA400/450，麦克奥迪实业集团有限公司）观察大鼠肾脏显微结构，每张切片再随机选取3个视野，分别在100及400倍下拍照。采用SPSS 13.0统计软件处理数据，数据以平均值±标准差（M±SD）表示。组间差异采用单因素方差分析，组内差异比较采用t检验，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著，用GraphPad Prism 6.02作图。

2 结果

2.1 各组大鼠体质量

多饮、多食、多尿及进行性体重下降是糖尿病患者的重要体征。建模前、后及实验末各组大鼠体重变化见表1。

表1 建模前、后及实验末大鼠体质量变化Table 1 The Changes of Body Weight Before，After and End of the Experiment M±SD，g

2.2 实验前、后各组大鼠血糖

血糖稳态的维持对机体生理生化反应十分重要，适时检测血糖可及时了解机体糖代谢状况。注射STZ前后及实验末各组大鼠血糖变化情况见表2。

表2 注射STZ前、后及实验末大鼠血糖变化Table 2 The Changes of Blood Glucose Before andAfter Injected STZ and at the End of ExperimentM±SD，mmol/L

2.3 各组大鼠血清Ins及GSP

实验末，各组大鼠血清Ins及GSP测试结果见表3及图1。

表3 各组大鼠血清胰岛素和糖化血清蛋白的变化Table 3 The Changes of Serum Insulin and GSPby the End of Experiment in Each Group M±SD

图1 3组大鼠血清胰岛素、糖化血清蛋白比较Figure 1. The Comparison of Serum Insulin and GSPin Three Groups at the End of Experiment

2.4 实验末各组大鼠肾功的变化

临床上，血清肌酐、血尿素氮及尿酸是反映肾脏功能状况的重要指标。实验末，3组大鼠Scr、BUN及UA测试结果见表4。

表4 各组大鼠血清肌酐、尿素氮和尿酸的测定结果Table 4 The Results of Scr，BUN and UAin Each GroupM±SD

2.5 各组大鼠肾脏显微结构观察

取各组肾脏组织常规固定后行石蜡切片、H.E.染色，选定视野后分别在100、400倍显微镜下拍照，用Motic数码显微镜（BA400/450）在100倍照片上测量肾小球周长、面积，由此计算形状因子（shape factor，SF）（表5）。

表5 各组大鼠肾小球周长、面积及形状因子推算结果Table 5 The Results of Perimeter，Area and SF in Glomerulus in Each Group M±SD

NC组大鼠肾小球结构正常（图2a），毛细血管腔开放（图2b）；DM组大鼠肾小球萎缩变小（图2c），基底膜出现不均匀增厚，足突融合、消失、系膜细胞增生（图2d），肾小囊腔变宽（图2d）；经8周有氧运动干预后，DS大鼠肾组织结构较DM组有明显改善，肾小球结构基本正常（图2e），毛细血管腔部分开放（图2f）。

图2 各组大鼠肾脏H.E.染色切片Figure 2. The Slices of Kidney H.E.Staining in Each Group

3 讨论

随着人们生活水平不断提高，糖尿病发病率也逐年提高，特别是2型糖尿病占比持高不下，可直接累及心、脑、肾等脏器，并出现肾功异常乃至衰竭等并发症，严重危害患者生命健康。其中，肾脏因其位置深、血流量大，功能变化比较隐匿不常被发现，一旦功能异常或迁延不愈或无法逆转而走向替代疗法。因此，关注2型糖尿病患者肾脏早期变化意义重大。

3.1 各组大鼠体质量、血糖、血清Ins及GSP的变化

2型糖尿病患者的典型体征为“三多一少”，即多食、多饮、多尿及体质量减轻。体质量变化在一定程度上是判定糖尿病病情发展转归的易测指标。由实验结果（表1）可知，注射STZ 1周后，DM、DS组大鼠体质量较NC组明显下降（P＜0.05），从侧面印证了该模型建立是成功的；8周跑台运动结束时，NC组大鼠体质量极显著（P＜0.01）高于建模前及实验末DM、DS组大鼠；此时DS组大鼠体重也显著（P＜0.05）高于DM组大鼠，表明中等强度有氧运动在一定程度上有延缓2型糖尿病大鼠体质量持续下降的作用。这与本组以前的实验结果及同类实验结果保持一致。

血糖是反映糖尿病病情及病程的重要指标。机体血糖稳态的维持对各项生理功能影响颇大。2型糖尿病由于机体胰岛素的分泌不足或胰岛素抵抗，使机体不能有效利用葡萄糖，造成血糖浓度超过肾糖阈而出现尿糖，持续高血糖易引发机体诸多不适及并发症。因此，血糖浓度成为评判机体糖代谢正常与否的重要指标，但其受诸多因素影响而波动。葡萄糖是机体能量代谢的重要底物，在运动与血糖关系上，前期研究证明运动能增强胰岛素的敏感性（Maiorana et al.，2002），并能上调骨骼肌GLUT4的基因和蛋白表达水平而提高其转运效率（龚云等，2017），抑制糖异生，也可改善蛋白质和脂肪代谢而降低糖、脂毒性（王桂芳等，2019），降低机体炎症反应（Mathur et al.，2008），改善氧化应激水平及血管内皮损伤状况，进而有效降低糖尿病患者的血糖水平（Lukács et al.，2015；Riddell et al.，2017）。有研究显示，对T2DM患者进行中等强度运动干预后，血糖水平明显下降（王耀光等，2004；徐国琴等，2002）。李俊等（2017）的研究提示，有氧运动可能通过改善胰岛素敏感性，降低血糖，减轻机体糖应激。朱洪竹等（2016）的研究表明，6周有氧游泳训练能显著降低2型糖尿病大鼠的血糖。注射STZ 1周后，DM、DS组大鼠血糖比注射前及NC组大鼠血糖极显著增高（P＜0.01，表2），说明注射STZ并复合高糖、高脂饲料建造的2型糖尿病模型是成功的。经过8周的跑台运动，DS组大鼠血糖尽管仍比NC组大鼠血糖极显著增高（P＜0.01），但与DM、运动前DS组大鼠相比，有显著下降趋势，说明中等强度有氧运动有阻抑糖尿病病情持续发展的作用。

胰岛素是体内唯一的降血糖激素，由胰岛β细胞分泌。血清蛋白及其他肽链N端为缬氨酸的蛋白质可与葡萄糖发生非酶糖基化反应，形成高分子酮胺化合物，结构类似于“果糖胺”（GSP），其半衰期较短，可有效地反映患者1～3周前的血糖均值，是追踪病情、观察糖尿病疗效的重要指标。本实验结果（表3、图1）显示，实验末，与NC组比较，DM、DS组大鼠血清Ins水平均极显著下降（P＜0.01），但DS组Ins水平较DM组显著上升（P＜0.05），表明中等强度有氧运动可升高DM大鼠血清Ins水平；在GSP方面，与NC组相比，DM组极显著升高（P＜0.01），而DS组较DM组显著下降（P＜0.05），仍显著高于NC组大鼠，提示有氧运动可以显著改善DM大鼠血糖水平。丛琳等（2001）曾对DM大鼠进行12周中低强度跑台运动训练，发现实验组大鼠血清Ins和C肽水平显著增高，糖代谢紊乱得到改善，并可减轻胰岛素抵抗。这与本实验结果基本一致。其机制可能是机体糖尿病状态下，因STZ对胰岛β细胞的损害而导致胰岛素分泌相对减少，血糖顺应性升高，而8周有氧运动应激后血糖几近耗竭，且这种下降的糖负荷或可反馈调节胰岛β细胞、外加受损的部分β细胞得到修复而分泌较多的胰岛素。具体机制可能涉及胰岛β细胞分泌胰岛素信号转导及调控过程。

3.2 有氧运动对DM大鼠肾脏结构的影响

肾脏是糖尿病累及的主要脏器，DN是糖尿病最严重和最常见的慢性并发症之一。糖尿病可通过多种途径损害肾脏，并累及从肾小球到肾小管和肾间质的几乎所有结构，但以肾小球病变最为突出。有研究证明，DN的病理变化主要表现为肾小球血管间质增生和胶原合成增加，造成结节型和弥漫型肾小球硬化（赵守香等，2004）。光学显微镜和电镜观察可见肾小球基底膜有线状沉积物，并已证实为IgG、IgM、HbAlc和白蛋白，且常发生于晚期，沉积反映了基底膜异常及漏出增加。本研究显示，NC组大鼠肾小球结构正常，毛细血管腔开放；DM组大鼠肾小球基底膜出现不均匀增厚，足突融合、消失、系膜细胞增生；经有氧运动干预后，DS组大鼠肾小球结构较DM组有明显改善，肾小球结构基本正常，毛细血管腔部分开放。另外，糖尿病属于内分泌性代谢紊乱综合症。机体糖代谢紊乱可导致肾脏微血管病变（蒋国彦，1992；孙洞箫等，1997），高血糖使胶原纤维之间的葡萄糖异常交叉联结增多、稳定性增强，导致糖化胶原纤维分解缓慢，同时糖化胶原与白蛋白、IgG结合增加，引起基底膜蛋白沉淀而增厚；高血糖还可使肾小球上皮细胞糖蛋白合成增加，致使基底膜增厚；基底膜纤维联结蛋白糖化，以其为媒介的胶原纤维之间的正常联结减少，造成肾小球滤过膜的孔径增大，导致微血管损伤，从而引发糖尿病肾病（关子安等，2000）。良好的血糖控制可使肾小球滤过率显著改善，延缓糖尿病微血管病变的发生。

SF是反应细胞组织形态结构变化的重要参数，本实验表示肾小球周长与面积的比值（崔亚南等，2002），可反应肾小球形状的变化。实验结果（表5）显示，DM组大鼠肾小球周长及面积均较NC组大鼠显著减小（P＜0.05），而SF显著增大（P＜0.05）；经8周有氧运动干预后，DS组大鼠肾小球面积较DM组大鼠显著增加（P＜0.05），但仍显著低于NC组大鼠。据此推测，8周有氧运动对受损的肾小球形态结构有显著改善作用。

3.3 有氧运动对DM大鼠肾功的影响

现已知，Scr是骨骼肌中磷酸肌酸代谢的终产物，而BUN是血浆中除正常蛋白质外的其他含氮代谢废物，二者虽不能作为肾脏结构及功能受损的早期预警敏感指标，但其升降确也能提示肾脏结构及功能的微细变化，特别是肾小球滤过功能及血尿屏障的微细变化，所以值得高度关注。本实验肾功检查结果（表4）显示，虽然各组Scr、BUN没有突破正常高值，但DM组大鼠Scr、BUN极显著高于NC组大鼠（P＜0.01），经8周有氧运动干预后，DS组大鼠Scr、BUN虽仍显著（P＜0.05）高于NC组大鼠，但比DM组大鼠显著下降（P＜0.05）。UA是嘌呤代谢的终产物，在本实验各组间均无统计学差异（P＞0.05）。提示8周有氧运动可以显著改善2型糖尿病大鼠肾脏功能，肾小球滤过能力显著增强。何黛等（2009）的研究提示，6周有氧运动可通过提高糖尿病肾损伤大鼠机体抗氧化能力、减少AR（醛糖还原酶）基因表达，由此抑制多元醇通路激活；并通过下调TGF-β1mNA和Smad蛋白表达，进而抑制TGF-β1/Smad信号通路传递效率。可能通过这两条途径发挥其对糖尿病肾损伤大鼠肾功能的保护作用。

DN的发病机制复杂，目前尚不完全清楚。但最根本的原因是在遗传易感的基础上出现了糖代谢异常、血流动力学障碍、生长因子和细胞因子等的免疫损伤。糖代谢异常通过晚期糖基化终末产物生成、多元醇通路激活、蛋白激酶C（PKC）的激活3条途径导致微血管病变，从而损伤肾脏。血流动力学改变的机械力和剪切力可能引起内皮细胞或上皮细胞的损害，从而破坏正常的滤过屏障，并且可直接激活PKC。据此推测，在DN早期，血流动力学异常可能发挥了重要作用，或为上述诸多因素相互作用、相互影响的综合表征。