不同方式运动对生长期大鼠TGFβ/BMP信号通路及骨生长的影响

2021-04-06赵常红李世昌胡晓磐

中国体育科技 2021年2期

赵常红，李世昌，孙朋，刘媛，胡晓磐，徐帅

软骨细胞是一种特异性骨骼细胞。生长板软骨细胞的肥大是骨纵向生长的基础，软骨细胞合成和分泌细胞外基质（extraceellular matrix，ECM）的基础。生长板的软骨细胞分为增殖层、肥大层，软骨细胞基本成列整齐排列，有序地进行增殖肥大，负责长骨的纵向生长（Sun et al.，2014）。转化生长因子 β（transforming growth factor β，TGFβ）作为调控软骨细胞分化与成熟的重要途径，在关节软骨的形成、软骨特性的维持和生长板软骨内成骨过程中发挥着重要作用，同时TGFβ是一种有效的体外诱导间充质干细胞（mesenchyma stem cell，MSC）成软骨细胞的分化剂（Wu et al.，2016），MSC聚集后，TGFβ信号进一步刺激软骨细胞增殖，同时抑制软骨细胞肥大和成熟（Song et al.，2007）。相反，BMP/Smad1、Smad5、Smad8通路的活化刺激肥大化标记Col10的表达，但随之刺激MMP13（Hellingman et al.，2011）。TGFβ抑制软骨细胞终末肥大分化，通过Smad2/3维持正常软骨（Studer et al.，2012）。纵向骨生长只发生在软骨，TGFβ1在人类已被证明可调控软骨细胞肥大化（Narcisi et al.，2012），调节生长板软骨内骨化过程实现，特别是在软骨内成骨过程中有维持静息层软骨细胞特性的作用（Kronenberg，2003；Yeung et al.，2014）。通过不同方式的运动来调节TGFβ/BMP信号通路，从而调节生长板增殖肥大影响骨纵向生长的研究目前鲜见报道。本实验采用不同方式的运动，如非负重运动（如游泳）、自负重运动（如跑步）和超自重运动（如跳跃练习）的方式，比较生长板软骨细胞肥大产生的变化，从骨组织生长的表型、细胞和细胞因子3个层面进行求证阐述。儿童青春期是身高增加的关键时期，而且SD大鼠作为研究生长板的动物模型，4周的SD大鼠相当于人的儿童期，12周相当于人的青春期后期（Andreollo et al.，2012），所以本实验以4周龄的SD大鼠3周适应性训练开始，运动6周后处理、取材，相当于青春期快结束基本成年阶段，身高基本定型。在这个年龄段研究不同的方式运动对生长板软骨细胞及细胞因子的影响，探究不同方式的运动如何通过TGFβ/BMP信号通路调节儿童青少年生长板软骨细胞，最终影响骨纵向生长的可能机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

本研究采用4周龄48只清洁级SD大鼠（雄性）作为实验动物，全部购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。随机分成4组，每组12只，即对照组（control group）、游泳组（swimming group）、跑台组（running group）和下跳组（down jump group），以下分别简称C组、S组、R组、D组。各组分笼饲养，每天训练结束后添加饲料并更换饮用水，定期更换垫料、鼠笼，以保持大鼠饲养环境卫生、清洁，相对湿度为50%～55%，温度为（24±3）℃。

1.2 运动方案

对照组（C组）：正常饲养，但不进行任何运动干预。游泳组（S组）：游泳训练池大小为50×60×50（长×宽×高，cm），水深40 cm，水温（20±2）℃。大鼠前3天游泳运动18 min/天，以后第1周游泳运动30 min/天，第2周开始每天游泳运动50 min，第3周开始每天游泳运动60 min，每周训练6天。跑台运动组（R组）：大鼠前3天跑台运动18 min/天，以后第1周跑台运动30 min/天，第2周开始每天跑台运动50 min，第3周开始每天跑台运动60 min，每周训练6天，跑速为1.2 Km/h，跑台坡度为0°。下跳运动组（D）：前3天跳跃运动18 min/天，以后第1周天跳跃运动30 min/天，第2周开始每天跳跃运动50 min，第3周开始每天跳跃运动60 min，每周训练6天，下跳高度为20 cm，频率为7～8次/min。对于4周龄的SD大鼠，游泳60 min左右会容易导致其力竭沉入水底溺死，60 min（20 m/min）的跑台运动属于高强度运动，60 min下跳运动（高度为20 cm，频率为7～8次/min）也属于高强度运动，随着3天的适应性训练和第1周30 min、第2周50 min的训练，大鼠年龄增至6周，到训练结束时各组大概达到此年龄阶段的中等运动强度（李良等，2018；许杰等，2018；Flores et al.，2006）。6周的训练结束后，进行后续实验。

1.3 实验动物取材

取各组大鼠后左肢骨（去软组织），放置PBS，用4%多聚甲醛固定，然后脱钙4周，脱钙后进行石蜡包埋、切片，然后进行HE染色，检测软骨细胞数量及分布，显示生长板软骨细胞的组织形态，用IPP测量生长板静息层、增殖层、肥大层及生长板的总厚度及各层百分比。

1.4 胫骨和股骨的长度和围度指标测试

训练结束后，将各组大鼠立即处死，取后肢胫骨和股骨，并左右分开，将肌肉和其他韧带组织剥离干净，并用电子秤进行称重，用游标卡尺测量胫骨和股骨的长骨和最细部位矢状面的厚度，进行数据记录和统计分析。

1.5 HE染色

将各组大鼠处死，在股骨头关节处脱臼取下其左侧后肢骨，剔除干净股骨和胫骨上附着的肌肉和韧带。然后浸入PBS中清洗2遍干净后，放置在4% PFA（50 mL EP管）溶液中，4℃冰箱固定过夜。然后再将10% EDTA溶液加入EP管中，进行20天的脱钙处理后进行石蜡包埋，切片。将石蜡切片在烤片机上（62℃）烤干（2～3 h）。二甲苯 II、二甲苯 I透明各 5 min，100%、95%、85%、75%、50%酒精复水各2 min，苏木精染色30 s。流水清洗2 min或观测冲洗的水变得无色即可，将切片放入染缸中，将染缸置于水龙头下，用流水清洗其中的切片。将切片浸入1%盐酸＋70%乙醇（1 mL浓盐酸＋99 mL 70%乙醇）分色2～5 s（直到颜色变成粉色），以镜检为准，再用水洗一遍。将切片缓慢放入氨水（1 mL氨水＋1 L水的比例）返蓝3～5 s，再将浸入伊红染15～30 s，自来水清洗切片。接着100%酒精2 min，100%酒精2 min，95%酒精2 min，二甲苯I、II透明各5 min，中性树胶封片过夜。然后在显微镜下拍片保存。利用Image pro plus 6.0软件进行标尺校正后进行测量。

1.6 生长板软骨细胞中相关细胞因子mRNA和蛋白检测

取生长板软骨放入液氮预冷过的研钵中进行研磨，提取RNA，然后反转录为cDNA，用SYBR荧光定量对TGFβ/BMP信号及下游基因进行检测，引物由Primer Premier 5软件设计（表1），由博尚生物科技有限公司合成。蛋白提取加裂解液研磨，然后移入EP管中冰上放15 min，4℃离心10 min，取上清，加入等体积loading buffer 100℃解构，加样，待loading buffer跑至底部，切胶转膜，待转好后用丽春红染带，用PBS洗3遍，剪膜标记目的蛋白，放入暗盒用5%的脱脂奶粉封闭1 h，然后加入目的蛋白一抗4℃过夜，用PBST洗5 min/3遍，加入相应的二抗2 h，再用PBST洗15 min/3遍，最后扫膜，用ImageJ软件进行灰度值分析。抗体分别购于abcam和CST公司。

表1 引物序列Table 1 List of Primer Sequences

1.7 数据处理

所有实验数据用Excel 2010和IBM SPSS 19.0进行统计和分析，所有数据均用M±SD（平均值±标准差）表示，统计分析均采用单因素ANOVA方差分析。*表示与C组比较，P＜0.05有显著性差异，**表示P＜0.01，有非常显著性差异；#表示与S组比较，P＜0.05有显著性差异，##表示P＜0.01，有非常显著性差异；&表示与R组比较，P＜0.05有显著性差异，&&表示P＜0.01，有非常显著性差异。

2 实验结果

2.1 不同方式运动后生长期大鼠后肢长度、围度比较

本研究发现（图1，表2），胫骨长度与C组和S组相比，R组和D组都非常显著性增加（P＜0.01）；股骨长度与C组和S组相比，R组和D组都非常显著性增加（P＜0.01）。

图1 不同方式运动后大鼠胫骨、股骨长度和围度指标示意图Figure 1. ASketch Map of the Length and Dimension of the Tibia and Femur of Rats after Different Ways of Exercise

表2 不同方式运动后大鼠胫骨、股骨长度和围度比较Table 2 Comparison of Length and Dimension of Tibia and Femur in Rats after Different Ways of Exercise n=12

2.2 不同方式运动后生长期大鼠生长板宽度比较

本研究发现，不同方式运动后，组间生长板的静息层宽度无显著性差异（P＞0.05）；增殖层宽度也无显著性差异（P＞0.05）；肥大层宽度只有D组与C组和S组相比，有非常显著性增加（P＜0.01），R组虽有增加趋势但无显著性差异（P＞0.05）；生长板的总宽度组间没有统计学意义（图2）。静息层占生长板总宽度百分比与C组比较，S组无差异性，与C组和S组相比，R组和D组均非常显著性下降（P＜0.01）；增殖层占生长板总宽度百分比组间无显著性差异（P＞0.05）；生长板的肥大层占生长板总宽度百分比与C组比较，S组无差异，与C组和S组相比，R组和D组都非常显著性增加（P＜0.01，表3）。

图2 不同方式运动后大鼠生长板各层宽度指标比较Figure 2. The Comparison of the Width Index of Each Layer of the Growth Plate of Rats after Different Ways of Exercise

表3 不同方式运动后大鼠生长板各层宽度指标比较Table 3 Comparison of the Width Index of Each Layer of Rat Growth Plate after Different Ways of Exercise n=6

2.3 不同方式运动后生长期大鼠生长板肥大细胞数比较

与C组相比，S组的生长板肥大软骨细胞无显著性差异（P＞0.05），R组显著性增加（P＜0.05），D组非常显著性增加（P＜0.01）。与S组相比，R组和D组的都非常显著性增加（P＜0.01，图3，表4）。

表4 不同方式运动后大鼠生长板肥大软骨细胞数比较Table 4 Comparison of the Number of Hypertrophic Chondrocytes in the Growth Plate of Rats after Different Ways of Exercise n=6

2.4 不同方式运动对TGFβ/BMP信号通路的影响

2.4.1 不同方式运动后TGFβ/BMP信号通路相关mRNA表达比较

本研究发现，BMP2 mRNA的表达水平与C组相比，S组无显著性差异（P＞0.05），R组和D组都非常显著性上调（P＜0.01），D组与R组相比，也显著性上调（P＜0.05）；Smad1 mRNA的表达水平只有D组与C组和S组相比显著性上调（P＜0.05）；Smad5 mRNA的表达水平与C组相比，S组无显著性差异（P＞0.05），R组和D组都显著性上调（P＜0.05）；Smad8 mRNA的表达水平与C组相比，S组无显著性差异（P＞0.05），R组和D组都非常显著性上调（P＜0.01）；TGFβ1 mRNA的表达水平与C组相比，S组的无显著性差异（P＞0.05），R组和D组都非常显著性下降（P＜0.01），与S组相比，R组和D组的显著性下降（P＜0.05）；Smad2 mRNA的表达水平，只有D组与C组和S组相比有显著性下降（P＜0.05），R组虽也降低但无显著性差异（P＞0.05，表5）。

表5 TGFβ/BMP信号通路mRNA表达的比较Table 5 Comparison of the Expression of mRNAin TGFβ/BMP Signaling Pathway

2.4.2 不同方式运动后TGFβ/BMP信号通路相关蛋白表达比较

本研究发现，BMP2蛋白的表达水平与C组相比，S组无显著性差异（P＞0.05），R组和D组都非常显著性增加（P＜0.01）；Smad1蛋白的表达水平与对照组C组相比，S组的无显著性差异（P＞0.05），R组和D组显著性增加（P＜0.05），与S组相比，R组和D组非常显著性增加（P＜0.01）；TGFβ1蛋白的表达水平与C组相比，S组的无显著性差异（P＞0.05），R组和D组的非常显著性降低（P＜0.01），与S组相比，R组的显著性降低（P＜0.05），D组的非常显著性降低（P＜0.01，图4，表6）。

图4 不同方式运动后大鼠TGFβ/BMP相关蛋白表达比较Figure 4. Comparison of Expression of TGFβ/BMPProtein after Different Ways of Exercise

表6 TGFβ/BMP蛋白表达比较Table 6 Comparison of Expression of TGFβ/BMPProtein

3 分析与讨论

3.1 不同方式的运动对大鼠后肢骨长度的影响

运动作为一种非常有效的刺激方式，来调节或促进身高的增加，这一点已在运动科学领域被证实。运动对身高确实是有非常重要的作用，但运动方式非常重要，并不是所有运动都会对四肢的增加有显著性的作用。罗冬梅（2002）的研究中发现，低强度的运动能改善生长期SD大鼠胫骨的长度和PTHrP mRNA的表达，负重和悬吊不利于大鼠骨长度的增加，但对此没有进一步的机制研究。而房冬梅（2007）的研究发现，持续跑台、持续游泳和间歇性跑台运动都有利于骨的矿化，但游泳对长骨生长的作用小于持续跑台运动，此结论和本实验一致。从本实验的结果来看，跑台和下跳方式的运动对大鼠后肢胫骨和股骨长度产生了非常显著性的影响。罗冬梅采用的是负重运动模型，而本实验室采用的是游泳、跑步和下跳模型，这3种运动主要是后肢用力，所以实验也是以后肢作为主要研究部位。测试之后发现，R组和D组的后肢胫骨和股骨长度相比C组和S组都有非常显著性增加；而R组和D组之间，C组和S组之间无显著性差异，这就说明，游泳运动对大鼠后肢长长作用不大，而跑台运动和跳跃运动对生长期大鼠后肢的增长是非常有利的。

3.2 不同方式运动对生长期大鼠生长板宽度的影响

儿童青少年时期是人体软骨内成骨实现骨生长的关键时期，生长板是儿童青少年时期特有的组织结构，在这一时期骨生长中，是通过生长板软骨细胞的不断增殖、肥大和矿化来保证骨骼的纵向生长有条不紊地进行。生长板是人体四肢纵向生长的主要结构，其结构和功能的变化，最终反映到身高上面。很多学者对此进行了研究，但大多都在生物和医学领域，在运动科学领域很少，而且鲜见对生长板的不同层的宽度百分比进行统计分析。本实验对生长板的不同层宽度进行了数据分析，而且在细胞层面进行了更为深入的探讨，从影响其差异变化可能的各层百分比进行了研究。

生长板作为一种特殊的组织结构，可以借助HE染色在生长板细胞组织学中清晰观察，反映生长板组织学形态特征。生长板包括静息层软骨细胞、增殖层软骨细胞和肥大层软骨细胞三层，各层结构特点为：静息层软骨细胞体积小，呈圆点状，细胞数量少；增殖层软骨细胞呈扁平铁饼状，细胞数量多；肥大层软骨细胞体积最大，颜色发亮，与增殖层软骨细胞明显不同。

不同方式运动的力学刺激会通过生长板促进或抑制生长，因此，不同方式运动的力学刺激促进或抑制生长板生长的关系值得重视。研究发现，力学刺激能够影响生长期骨的纵向生长（Gkiatas et al.，2015；O’Conor et al.，2013；Rolfe et al.，2013）。但是这种力学刺激有个“阈值”，Ehrlich等（1972）研究发现，力学刺激强度过高可能会导致生长板过快的老化或生长停止，而无法实现追赶生长导致生长板狭窄。Troib等（2015）研究发现，跑台训练结合生长激素（growth hormone，GH），能促进CKD大鼠胫骨线状生长，而且对小梁骨形成显示出有益的效果，优于GH单独治疗，说明合理的负荷有利于骨骼的纵向生长，过低或者过高的负荷反而对骨骼的纵向生长不利。Huang等（2002）的研究发现，大鼠进行跑台训练后，生长板各层软骨细胞数量、生长板总宽度与未运动组不具有统计学意义。Niehoff等（2004）、乔盼迪等（2016）研究也发现，无论高强度还是低强度运动，生长板中增殖层宽度与不运动组相比均显著性降低。这个可能与实验动物年龄和运动方式有关，选择的大鼠年龄大，运动训练结束后已经超过成年的18周，随着年龄的增加、衰老导致肥大层宽度和生长板总宽度降低，运动强度过大也会加速生长板的衰老和退化，导致肥大层宽度和生长板总宽度降低。

本实验采用不同方式的运动，通过生长板组织染色，对生长板的静息层、增殖层、肥大层及生长板各层相加计算出生长板总的宽度，以及各层在总宽度所占百分比的数据统计，来探讨运动对于生长板软骨内成骨的影响。研究发现，不同方式运动组与对照组相比生长板静息层没有统计学意义，增殖层也没有统计学意义，但肥大层S组和R组与对照组相比没有统计学意义，但D组与C组和S组相比非常显著性增加，与R组没有显著性差异，生长板总宽度也没有统计学意义；紧接着对各层占总宽度百分比进行统计发现，静息层所占百分比出现了统计学意义，R组、D组和C组、S组比较都显著性降低，但增殖层所占百分比没有出现差异，肥大层所占百分比R组、D组也显著性增加。简单地说就是跑台运动和下跳运动后生长板静息层宽度变化没有统计学意义，但所占生长板总长度百分比出现统计学意义，表明跑台运动和下跳运动导致静息层的下降，但增殖层都没有统计学意义，而肥大层出现显著上升。不同方式的运动的力学刺激不同，导致生长板软骨细胞各层产生了不同的变化，出现上述现象的原因可能有以下几方面：1）静息层骨细胞数量减少，可能由于跑台运动和下跳运动生长板软骨细胞增值率增加导致；2）既然增值率增加，增殖层宽度理论上应该增加，但是没有发生变化，可能是由于肥大速率加快导致增殖速率被抵消；3）跑台运动和下跳运动可能确实能促进软骨细胞的肥大成熟，使得生长板软骨细胞肥大速率增加。

3.3 不同方式运动对大鼠生长板肥大软骨细胞数量的影响

生长板软骨细胞肥大化的程度，在很大程度上决定了长骨的增长速率。在同龄大鼠中，生长板软骨细胞肥大个数越多，说明细胞成熟的越多，生长板在长骨纵向生长过程中发挥的作用、贡献也就越高。本研究发现，R组和D组生长板肥大软骨细胞的数量都出现明显增多，肥大细胞数量的增多也就意味着肥大软骨细胞层面积的增加，这与前面统计得出的R组和D组后肢股骨生长板肥大层宽度和肥大层百分比显著性增加是一致的，说明跑台运动和下跳运动能促进生长板软骨细胞的肥大，有利于软骨内成骨，促进骨的纵向生长。

3.4 不同方式运动对生长期大鼠生长板TGFβ/BMP信号通路的影响

BMP在调控软骨细胞分化成熟中作用不尽相同。研究发现，BMP2有促进软骨细胞增殖、肥大的作用，在软骨修复和骨折恢复治疗领域应用比较广泛，由于BMP2在骨修复过程中既有促进合成代谢，又有促进分解代谢的作用，所以已被允许用于脊椎融合及长骨腔骨的急性开放性治疗。尤其在修复治疗长骨缺损中，BMP2能促进骨吸收，加速骨的重建（Tannoury et al.，2014）。在软骨内成骨过程中也同样具有促进软骨内成骨的作用。但BMP4作用正好与其相反，在体内、外的研究发现，BMP4可促进MSC分泌Col2及蛋白聚糖，促进MSC向软骨细胞分化，同时又抑制软骨细胞肥大（Pregizer et al.，2015）。目前，比较不同运动方式通过调节BMP来调节软骨细胞的分化和软骨内成骨的研究还较少。

体内和体外的研究发现，BMP能诱导软骨细胞的增殖，增加骨的元素，如果缺失BMP信号通路或者过表达BMP的拮抗剂，或者显性抑制BMP受体的形成，都会降低骨骼的纵向生长。已经证明，BMP信号通路和Ihh信号通路有几个阶段是相互影响并调节软骨细胞发育的，同时平行调控软骨细胞的增殖。BMP又诱导细胞释放Ihh，直接调控软骨细胞发生肥大。此外，软骨细胞的肥大过程独立于Ihh/PTHrP信号通路，受BMP信号通路的负调控促进软骨细胞增殖（Minina et al.，2002），并通过负反馈循环与Ihh/PTHrP一起调节软骨细胞的增殖成熟（Salazar et al.，2016）。

BMPI型受体有两种，包括：BMPRA1和BMPRB1，可以激活磷酸化同样的下游信号通路Smad1、5、8（Presley et al.，2017；Wan et al.，2005），即使 PTHrP存在时，BMP也能导致Ihh的高表达，Ihh信号通路在生长板软骨细胞成熟阶段不依赖于BMP的调节，Ihh的表达贯穿于生长板软骨细胞成熟的始终，BMP在Ihh的表达上起着重要的调节作用，高水平的BMP必然在下游信号通路Smad1、5、8调节软骨细胞成熟方面引起Ihh的升高（Ma et al.，2013），PTHrP通过调控BMP信号通路调控Ihh的表达，PTHrP负调控Ihh不一定是直接的，可能通过BMP信号通路（Grimsrud et al.，2010）。还有其他一些机制如胞外的粘合蛋白会抑制胞内信号通路如BMP，这些信号通路间的复杂平衡一起调节骨的形成和骨的纵向生长（Estrada et al.，2013；Luo，2016；Zhang et al.，2017）。

生长板软骨通过一个程序性的细胞增殖、肥大、分化、钙化、凋亡，最终被骨取代。TGFβ信号被转移到细胞核内调节Smads信号。Smad1、5、8对BMP信号通路起作用，Smad2、3对TGFβ信号通路起作用。Smad3功能的缺失会导致T细胞对TGFβ响应降低。Smad3在发育阶段不会影响软骨的形成，但在3～4周的Smad3-/-小鼠发现生长板肥大带逐渐增加，这个表型在5～6周的成熟小鼠变得更加明显，这说明Smad3的缺失导致生长板软骨细胞的肥大分化。研究还发现，在Smad3-/-小鼠生长板Col10表达增加，蛋白多糖含量下降，而且TGFβ1处理的小鼠抑制软骨细胞的肥大而不是Smad3-/-，说明TGFβ1在抑制软骨细胞的肥大分化方面作用是大于Smad3的。

本实验的研究结果发现，和C组比较，S组BMP/Smad1、5、8信号通路未发生显著性变化，而R组和D组发生显著性变化，而且在mRNA水平D组BMP2较R组也有显著性差异，这两种方式的运动通过BMP信号通路作用于下游Smad1、5、8，促进了软骨细胞肥大和矿化阶段Col10和MMP13的表达，进而反映这两种方式促进了生长板软骨细胞的增殖和肥大，但由于仅在Smad8蛋白上D组较R组出现显著性差异，还不能说明D组较R组的运动方式更有利于软骨内成骨。有报道发现，BMP的上升有利于骨量的增加，但在本研究可能是多条信号通路共同作用的结果。而且TGFβ1在mRNA水平和蛋白水平都在R组和D组较C组和S组出现了显著性差异，而S组和C组之间无统计学意义，说明游泳运动对软骨细胞的肥大作用不是很有效，和生长板数据统计结果一致。R组和D组的显著性下降可能与生长板软骨细胞的肥大和肥大层宽度增加有关，且蛋白表达上D组较R组出现的下降更为显著，这些效果的累加，也是可能导致Runx2显著升高的原因，最终导致软骨内成骨加强，骨的纵向生长明显。