长期高强度间歇训练对中年大鼠骨骼肌蛋白合成和降解的影响

2021-04-06崔新雯张一民孔振兴于晶晶

中国体育科技 2021年2期

崔新雯，张一民，汪赞，孔振兴，苏浩，于晶晶

骨骼肌是人体重要的运动器官，骨骼肌质量直接影响着机体的体质健康水平。拥有绝对数量蛋白质的骨骼肌，也是蛋白质代谢非常活跃的器官。作为有丝分裂后的组织，骨骼肌质量和大小受蛋白质代谢的调节，即受到蛋白合成和降解的动态平衡控制。蛋白质的合成和降解受复杂的信号网络系统所调控。骨骼肌蛋白合成对骨骼肌质量的重要性不言而喻。研究发现，Akt/mTOR信号通路是调控骨骼肌蛋白合成中极为重要的环节，且运动的调节作用尤为突出。多个系统参与调节骨骼肌蛋白的降解，如泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system，UPS）、自噬-溶酶体系统（autophagy-lysosomal system，ALS）（Wohlgemuth et al.，2010）。UPS主要降解肌纤维和大多数可溶性短寿命蛋白，促进了骨骼肌重塑，并有效避免了各种刺激因素引起的有毒有害物质的积累，但当其活性被过度激活时，便使骨骼肌质量朝着负增长的方向发展，威胁骨骼肌健康，因而UPS活性的适宜激活对骨骼肌质量至关重要。研究发现，运动可因运动方式、运动强度、运动时间等的不同对UPS的活性产生不同影响。ALS主要降解细胞器和长寿命蛋白，使细胞得以更新与重建（Lavandero et al.，2013；Sandri，2010）。细胞通过保持基础自噬水平，去除功能失调或受损的成分，是维持细胞正常功能和质量控制所必需的（Lee et al.，2010；Lira et al.，2013）。多项研究表明，运动引起的自噬水平的适宜激活，促成了不同生理病理条件下骨骼肌重塑与内环境稳态的维持，有助于防治骨骼肌减少的发生发展（Kim et al.，2016；Pigna et al.，2016；Schwalm et al.，2015a；Vainshtein et al.，2016）。但目前关于基础自噬水平在骨骼肌运动适应中的调节作用研究不足，尚待探索。

在增龄、疾病或者不适的环境状态下，众多因素可通过影响骨骼肌的蛋白质合成与降解，进而影响骨骼肌质量，对骨骼肌健康产生威胁。维持正常的骨骼肌质量对于骨骼健康、骨骼肌健康、生活质量，以及肌少症的预防意义重大。身体活动是提高骨骼肌质量、增进骨骼肌生理功能的重要保障，也是一种非常经济、有效的手段。传统有氧运动有助于提高有氧代谢水平，在维持骨骼肌质量和预防肌肉减少上表现出良好的干预效果（Harber et al.，2009，2012；Morris et al.，2013），但在实际运用中，因其运动时间长、动作单调、易使人感到枯燥等特点，并不易于被大众广泛接受。因而，优化运动方式显得更为重要。

高强度间歇训练（high-intensity interval training，HIIT）是一种相对于中等强度持续运动的训练方式，其特点是进行多次持续时间为几秒到几分钟的高强度练习，期间穿插静息或低强度练习以形成间歇期，使练习者不能得到完全恢复（黎涌明，2015；Billat，2001）。在进行HIIT时，受试者可以得到多次重复的高强度刺激，采用较少的运动时间即可同时提高有氧和无氧代谢能力（Gibala et al.，2008）。此外，HIIT在改善体脂的含量与分布、控制血糖血脂、提高胰岛素敏感性，及改善血管内皮功能上，都产生了积极的干预效果（王京京等，2015）。不仅如此，与传统中等强度持续训练（moderate intensity continuous training，MICT）相比，HIIT具有更高的运动愉悦感和训练依从性，这使HIIT显示出明显的经济性和实用性等优势（Heinrich et al.，2014）。一些以80%～90%最大摄氧量（O2max）为运动强度，重复4～5次，每次2～4 min的HIIT的研究发现，无论对无锻炼经历的大众、高龄人群，还是慢性病患者，HIIT均产生了可观的应用价值，而对其兼顾安全性和锻炼效果的进一步探索吸引了众多学者的研究兴趣（Holloway et al.，2015；Nybo et al.，2010）。

HIIT除了可以提高骨骼肌有氧和无氧代谢能力，其对骨骼肌质量有何影响？决定骨骼肌质量的蛋白合成与降解在HIIT的作用下是否产生适应性变化？该变化的调节机制为何？这与传统的MICT相比有何异同？这些问题都亟待进一步研究。

1 实验材料与方法

1.1 实验动物与分组

24只9月龄雄性Wistar大鼠，体重608.71±72.80 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证号：SCXK（京）2012-0001]，于北京体育大学SPF级动物实验室饲养，相对湿度55%～70%，温度22℃～24℃，昼夜明暗交替各12 h。所有大鼠分笼饲养，每笼3～5只，自由饮水、摄食。大鼠随机分为：安静对照组（C组）、MICT运动组（M组）和HIIT运动组（H组），每组8只。实验设计及动物使用通过了北京体育大学动物实验伦理委员会审查。

1.2 训练方案

所有大鼠适应性喂养后，进行1周的适应性训练，每天15～20 min，跑台速度为10 m/min，坡度为0°。之后，进行为期12周的正式运动训练。C组大鼠正常饮食生活，无运动训练。M组和H组大鼠的训练时间为每周一至周五下午14：00—16：00。MICT和HIIT方案见表1和表2，跑台坡度均为10°，每周训练5次。该方案结合Bedford等（Bedford et al.，1979）的研究、心衰患者的研究（Angadi et al.，2015；Arena et al.，2013；Smart et al.，2013）及前期预实验摸索最终确定。运动强度根据大鼠在训练前、训练4周后、8周后所测得的O2max所对应的跑速的运动强度百分比而控制。

表1 MICT方案Table 1 The Protocol of MICT

表2 HIIT方案Table 2 The Protocol of HIIT

1.3 样本采集与保存

所有大鼠在末次运动结束24 h后进行取材，以5%水合氯醛1 ml/100 g体重对大鼠腹腔注射进行麻醉。剥离左侧比目鱼肌，用电子秤称量肌肉湿重。剥离右侧比目鱼肌，取肌腹截面1×1×1 mm大小投入预冷的2.5%的戊二醛中，随后4℃存放，以备超薄切片的制作。取50 mg肌腹用锡纸包裹投入液氮中，随后转入-80℃冰箱中保存，以备蛋白相对含量的测定。

1.4 指标检测与方法

1.4.2 蛋白质免疫印迹（western blot）检测

取出在-80℃保存的每只大鼠比目鱼肌各50 mg，分别迅速投入预先加好磷酸酶抑制剂（04906837001，Roche）的RIPA裂解液（R0278，Sigma）EP管中，冰浴匀浆20 s 3次。静置30 min后，4℃，12 000 rpm离心5 min取上清。使用BCA蛋白测定试剂盒（23227，Thermo Scientific）测定所有样品的蛋白浓度，加入相应比例的（4×）裂解液和上样缓冲液（NP0007，Invitrogen），将蛋白浓度调为一致，70℃变性10 min。SDS-PAGE（NP0342BOX，Invitrogen）凝胶电泳200 V，45 min，300 mA转膜1.5～2 h，配置5%的脱脂牛奶对PVDF膜（IPVH00010，Immobilon-P）封闭0.5～1 h，使用 5% BSA配制一抗 Akt、mTOR、P70 S6K、4EBP1、Ubiquitin、MuRF-1、MAFbx、Beclin 1、LC3、P62、ULK1、COXIV 、PGC-1α和GAPDH，4℃过夜，摇床孵育。次日洗膜后，二抗室温摇床孵育1 h，洗膜后将条带置于化学发光成像系统（ChemiDoc Touch Imaging System，Bio-Rad），滴加ECL化学发光试剂（34095，Thermo Scientific）进行曝光显影，利用Image Lab 5.1软件进行灰度值分析，计算目的蛋白相对表达量。

1.4.3 透射电子显微镜观察自噬体形态结构

电镜超薄切片的制作按如下步骤进行：1）取出固定于2.5%戊二醛中的标本；2）磷酸缓冲液浸洗3次，每次10 min；3）置于四氧化锇固定液4℃固定2 h；4）双蒸水冲洗3次，每次10 min；5）乙醇梯度脱水：50%～70%～90%各10 min；6）100% 乙醇脱水 2次，每次15 min；7）环氧丙烷置换2次，每次10 min；8）1：1的环氧丙烷和树脂浸透，室温1 h；9）1：4的环氧丙烷和树脂浸透，室温1 h；10）纯树脂浸透，室温 2 h；11）纯树脂包埋；12）聚合、修块；13）制作1 μm厚度的半薄切片，天青-美兰染色，光镜下定位观察；14）制作700 nm超薄切片，醋酸双氧铀，枸橼酸铅染色。之后，透射电子显微镜观察，透射电镜特殊成像系统（CCD）拍照。各组随机观察40个视野（×2 000）。

1.5 数据统计与处理

使用SPSS 19.0、GraphPad Prism 5进行分析处理，采用单因素方差分析，事后比较采用Bonfferonni校正，以P＜0.05为显著性检验标准。

2 实验结果

2.1 HIIT对中年大鼠骨骼肌湿重的影响

采用协方差分析训练对中年大鼠比目鱼肌湿重的影响，以体重为协变量，在体重=610.4 g时评估不同组间比目鱼肌湿重的差别，发现与C组（0.28±0.03 g）相比，M组（0.31±0.04 g，P=0.036）和H 组（0.30±0.03 g，P=0.040）比目鱼肌的湿重均提高。

2.2 HIIT对中年大鼠骨骼肌蛋白合成的影响

Western blot检测 AktSer473、mTORSer2448、P70 S6KThr389、4E-BP1Thr37/46的蛋白表达，采用单因素分析HIIT对中年大鼠比目鱼肌蛋白合成的影响。结果发现，相比C组，H组的mTORSer2448/mTOR比值提高了26%（P=0.049）；M组P70 S6KThr389/P70 S6K比值提高了40%（P=0.028），H组 P70 S6KThr389和P70 S6KThr389/P70 S6K比值提高了70%（P=0.001）；训练对AktSer473和4E-BP1Thr37/46的磷酸化蛋白表达无明显差异（P＞0.05，图1）。

图1 训练对比目鱼肌蛋白合成相关蛋白表达的影响Figure 1. Effects of Training on the Expression of Protein Synthesis Related Proteins

2.3 HIIT对中年大鼠骨骼肌蛋白降解的影响

通过检测泛素化蛋白和两个肌肉特异性E3泛素连接酶MuRF-1和MAFbx的蛋白表达，分析HIIT对中年大鼠趾长伸肌泛素-蛋白酶体系统的影响。结果显示，相比C组，MICT和HIIT没有对泛素化蛋白和MuRF-1蛋白含量产生明显影响（P＞0.05），但对MAFbx的蛋白表达有降低的趋势，均为20%（P=0.058，P=0.052，图2）。

图2 训练对泛素-蛋白酶体系统关键组分的影响Figure 2. Effects of Training on the Expression of Ubiquitin-proteasome System Related Proteins

通过电镜观察自噬体，发现C组肌原纤维中可见散在分布的自噬体，而H组和M组可见较多处于后期降解阶段的自噬体，且线粒体增多、聚集（图3）。通过western blot检测细胞自噬相关蛋白表达发现，相比C组，M组和H组的LC3II蛋白表达分别提高了88%（P=0.000）和64%（P=0.004），H组COXIV蛋白表达提高了56%（P=0.024）。但训练对LC3II/LC3I、P62、ULK1Ser757/ULK1比值、Beclin-1和PGC-1α的表达均没有显著影响（图4）。

图3 训练对自噬体形成的影响Figure 3. Effects of Training on the Formation of Autophagosomes

图4 训练对自噬-溶酶体系统相关蛋白表达的影响Figure 4. Effects of Training on the Expression ofAutophagy Related Proteins

3 分析与讨论

探索连续12周的HIIT对中年大鼠比目鱼肌湿重、蛋白合成和降解相关蛋白的影响，发现HIIT可能通过促进比目鱼肌蛋白合成、降低MAFbx蛋白表达和提高细胞自噬活性，促进比目鱼肌质量的提高。

骨骼肌质量是机体健康的基石，防止或延缓骨骼肌质量的丢失，使其维持较高的水平对骨骼肌健康至关重要。运动作为一种经济有效的干预手段已得到了广泛认可。研究发现，有氧运动训练可以有效缓解老年骨骼肌质量的丢失（Betik et al.，2008；Kim et al.，2013）。而Betik等（2009）的研究指出，有氧运动并不足以抵抗衰老导致的骨骼肌质量和功能的下降，老年骨骼肌的运动可塑性降低。这部分说明，衰老骨骼肌可能对有氧运动的敏感性下降，由训练产生的抗衰老效果减弱了。本研究将关注对象的年龄提前，探索了有氧训练对中年大鼠骨骼肌质量的影响，发现长期HIIT提高了中年大鼠比目鱼肌质量，这间接反映了中年时期骨骼肌质量有较高的可塑性，以该时期作为切入点进行运动干预或将产生较大效果。

Akt是一种丝/苏氨酸激酶，是雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）的重要调节者。mTOR参与了蛋白翻译的启动，其中Ser2448位点的磷酸化被认为是mTOR活性激活的标志（Bolster et al.，2002），一旦被激活，mTOR可以通过下游的效应蛋白：核糖体蛋白S6蛋白激酶（P70 S6K）和真核细胞翻译起始因子4E（eukaryotic translation initiation factor 4E，eIF4E）的抑制蛋白 4EBP1，提高翻译起始效率（Pause et al.，1994）。本研究发现，HIIT训练后mTOR和P70 S6K蛋白的磷酸化水平提高，而Akt则无明显变化，推测可能存在有非Akt依赖的蛋白合成信号通路（Hornberger et al.，2004；Pallafacchina et al.，2002）。实际上，Akt在生长激素诱导的蛋白合成信号通路中是必须的，而机械刺激则可以通过非Akt依赖的途径诱导mTOR依赖的蛋白合成。研究发现，在耐力运动的恢复期，Akt没有发生改变（Nader et al.，2001），而mTOR、P70 S6K、4E-BP1、eEF2和S6等蛋白的磷酸化水平普遍提高（Mascher et al.，2007；Mascher et al.，2011）。推测耐力运动后对蛋白合成的调节信号主要汇集于mTOR。Goodman等（2010）研究发现，通过过表达小分子GTP酶Rheb（ras homologue enriched in brain，Rheb）可促使mTOR通过非Akt依赖的信号途径调节蛋白合成，诱导骨骼肌肥大适应，弥补了骨骼肌质量控制的分子调节机制。

相比传统MICT，HIIT在促进比目鱼肌mTOR信号通路蛋白的磷酸化表达上作用更明显，这可能是由于HIIT提供的是变换负荷，相比MICT的恒定负荷，能够动员更多肌纤维。同时，HIIT由高低强度运动组成，而这些脉冲式的高强度的肌肉收缩活动，放大了mTOR分子信号通路的激活效应，成为促成骨骼肌蛋白合成率的关键因素（Witard et al.，2016）。然而，虽然HIIT可以提高骨骼肌蛋白合成，但不可否认的是，与只接受抗阻训练相比，有氧运动+抗阻运动或HIIT+抗阻运动使骨骼肌的蛋白合成反应减弱（Fernandez-Gonzalo et al.，2013；Fyfe et al.，2018），因此单纯以促进肌肉肥大为目的的训练方式，抗阻运动为最佳。但是结合HIIT的其他健身效果，例如，提高有氧、无氧工作能力，及较高的运动愉悦性，HIIT值得大力推广。

研究发现，一次离心运动（Stupka et al.，2001）或大强度运动（Zhu，2014）所引起的肌肉损伤与泛素化蛋白增多、泛素-蛋白酶体系统的过度激活有关，而在长期运动适应下，泛素化蛋白含量的增加减弱，蛋白降解有所缓和。本研究发现，HIIT和MICT并没有使比目鱼肌泛素化蛋白明显变化，这个结果和前人的研究发现一致（Cunha et al.，2012；Jamart et al.，2012）。实际上，泛素化蛋白水平在特定时间内反映了蛋白泛素化过程和泛素化蛋白降解过程间的动态平衡，当蛋白泛素化过程和泛素化蛋白降解过程共同提高或减少时，泛素化蛋白的波动并不会很大。本研究结果说明，运动可能对蛋白泛素化过程和泛素化蛋白降解过程起到了同向作用，因而没有影响细胞内泛素化蛋白水平。MuRF-1和MAFbx是两个肌肉特异性的E3泛素连接酶（Rom et al.，2016），它们催化泛素与靶蛋白结合，在肌肉泛素-蛋白酶体系统降解途径中有着重要作用。当骨骼肌中MuRF-1和/或MAFbx的表达增加时，泛素-蛋白酶体系统功能亢进，促进对MuRF-1和/或MAFbx底物蛋白的降解过程（Altun et al.，2010；Clavel et al.，2006）。研究表明，有氧训练可以通过降低蛋白降解标志蛋白MAFbx和MuRF-1的表达，进而抑制泛素-蛋白酶体途径的蛋白降解，且在对抗骨骼肌减少的应用上取得了良好效果（Chen et al.，2011；Fernandez-Gonzalo et al.，2013；Vechetti-Junior et al.，2016）。而目前有关HIIT对泛素-蛋白酶体系统影响的研究少有报道。本研究发现，12周的HIIT降低了比目鱼肌MAFbx的蛋白表达，且与MICT的效果相当，推测MAFbx对不同形式有氧训练的反应敏感性差别不大。

运动后骨骼肌良性适应的重要机制之一就是细胞自噬适宜水平的激活。本实验研究了HIIT和MICT对骨骼肌细胞基础自噬水平影响。首先采用电镜观察各组大鼠比目鱼肌纤维的超微结构及自噬体的产生情况，发现M组和H组自噬体和线粒体多于安静对照组，这一结果与马晓雯等（2016）有关长期中等强度运动对心肌细胞自噬影响的电镜结果相一致，但没有出现该研究发现的大强度运动导致心肌自噬的过度激活，致使心肌纤维严重受损的情况。在对自噬相关蛋白进行检测后发现，M组和H组均显著提高了比目鱼肌LC3II的蛋白含量，且产生提高LC3II/LC3I比值的趋势。说明本实验条件下HIIT有效激活了基础细胞自噬的适宜活性，且与MICT效果相当。适宜的细胞自噬水平，可使细胞内受损或老化的细胞器被及时清除，同时细胞可以得到更多的能源物质，这对骨骼肌质量和功能的维持和提高有极为重要的意义。为进一步探索调节HIIT诱导的细胞自噬活性改变的信号通路，本研究进一步检测了经典的细胞自噬诱导信号：mTORC1和Beclin-1的相关信号分子的表达。mTORC1可以通过去磷酸化ULK1Ser757，以激活ULK1复合体，进而促进细胞自噬下游信号。Beclin-1在自噬体形成初期发挥重要作用，主要调控其他自噬相关基因蛋白在自噬体膜的定位。本研究发现，HIIT无论对mTORSer2448、ULK1Ser757磷酸化水平还是Beclin-1的蛋白表达均无显著影响，这与反应细胞自噬活性的LC3II蛋白变化不一致。类似的结果也出现在Schwalm等（2015b）、Kim等（2013）以及Jamart等（2013）的研究中。推测长期HIIT诱导的骨骼肌细胞基础自噬水平的提高可能受到非mTOR依赖和非Beclin-1依赖的信号通路调节。本研究同时发现，HIIT明显提高了线粒体含量标志物COX的蛋白表达，MICT表现出一定的提高趋势。COX是调控线粒体氧化磷酸化水平的线粒体呼吸链末端的酶复合体，仅在线粒体中有表达，其表达水平可一定程度反映线粒体的含量。结合本研究电镜下所见线粒体的增多、聚集，这或许提示，HIIT对基础细胞自噬水平的提高与线粒体适应性增加存在某种联系。相比MICT，HIIT的高强度运动对氧气的需要量更大，可能促成了对线粒体生物合成更深刻的刺激。

并非所有研究结果均支持长期运动适应提高骨骼肌细胞自噬活性，Kwon等（2017）发现，长期抗阻训练（8周）抑制了细胞自噬诱导的蛋白降解，研究结果的不一致性可能与训练手段（抗阻训练vs.有氧训练）及研究对象年龄（14周龄vs.9月龄）不同有关。抗阻训练对线粒体的影响较小，而有氧训练可以通过同时提高线粒体自噬和线粒体生物合成作用以促进线粒体周转，因而激活了基础自噬水平。此外，本研究对象为中年大鼠，相比年轻大鼠，有更多的受损细胞器和错误折叠蛋白需要通过提高自噬活性来加速清理，这也是有氧训练诱导细胞自噬水平提高的重要原因。

本研究发现，mTOR蛋白合成信号通路和UPS、ALS的骨骼肌蛋白降解系统均发生了适应性变化，它们之间相互作用，共同控制着细胞内环境，调节比目鱼肌蛋白的合成和降解，最终决定比目鱼肌的质量水平。本研究提示，长期HIIT提高了比目鱼肌蛋白合成，激活了细胞自噬活性，总体以蛋白合成占优势，可能是HIIT提高比目鱼肌质量的重要机制，且HIIT与传统MCIT效果相当。本实验室前期对以II型肌纤维为主的趾长伸肌也进行了类似研究（崔新雯等，2019），同样发现长期HIIT可以提高中年大鼠趾长伸肌质量，但对有关趾长伸肌蛋白合成和蛋白降解的调控机制与本研究以I型肌纤维为主的比目鱼肌的有所不同（如与趾长伸肌相比，比目鱼肌对HIIT诱导的蛋白合成的反应更强烈，自噬流通畅性的反应较微弱）。这在某种程度上体现了不同肌纤维类型的特异性反应，也共同说明了HIIT对骨骼肌质量的积极作用。