金匮肾气丸防治绝经后骨质疏松症的物质基础探索※

何达东,陈凯奇,陈敬恒

(广东省广州市番禺区中医院,广东 广州511400)

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是中老年女性常见的代谢性骨病,绝经后女性雌激素水平下降,骨含量丢失,骨脆性和骨折风险增加,严重的骨质疏松性骨折可伴有肺栓塞、重症肺炎等,危及患者的生命,增加家庭与社会的经济负担[1-2]。PMOP归属于中医“骨痿”“骨痹”范畴,病机总属肾精亏虚,结合肾藏精、主骨生髓理论,临床常以补肾填精法为主要治则[3]。金匮肾气丸出自《金匮要略》,由茯苓、附子、桂枝、牡丹皮、山药、山茱萸、熟地黄、泽泻组成,功擅补肾填精、温阳化气,主治肾阳虚病证。多项研究表明,金匮肾气丸治疗PMOP具有良好疗效[4-5]。但关于该药物的作用机制目前尚不明确。借助系统生物学理论方法,筛选中药方剂中的有效活性成分并预测其作用靶点,有助于深入理解中医药治疗作用的物质基础[6]。本研究通过筛选、预测金匮肾气丸组方中各中药的有效活性成分及其治疗PMOP的靶点基因,探索该药物治疗作用的物质基础,以期为后续研究提供思路。

1 材料与方法

1.1 金匮肾气丸 通过中药系统药理学数据分析平台(TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php)收集金匮肾气丸组成药物的活性成分,以口服生物利用度(OB)＞30%、类药性(DL)＞0.18为口服中药的有效活性成分筛选标准[7-8]。分别整理各单味药的有效活性成分及对应的疾病靶点。

1.2 PMOP治疗靶点收集 人类基因组数据库Gene Cards(https://www.genecards.org)与毒理学比较数据库CTD(http://ctdbase.org/)是目前国际较为公认的收录人类疾病治疗靶点的综合数据库。以“postmenopausal osteoporosis”为关键词在上述数据库进行检索,分别下载、整理靶点数据,与金匮肾气丸有效活性成分对应的疾病靶点互相映射,获得金匮肾气丸有效活性成分防治PMOP的疾病靶点。

1.3 目标靶点蛋白互作分析与关键靶点筛选 靶点基因翻译的蛋白质是靶点基因执行生物学功能的物质信息,不同蛋白质之间存在互相作用的关系,如协同、拮抗、信号转导等多种方式。蛋白互作(PPI)分析有助于发现基因间的关联性并进一步进行针对性研究。将获得的金匮肾气丸防治PMOP的靶点基因上传至在线蛋白互作分析工具STRING(https://string-db.org/),选择物种为“homo sapiens”,最小互作分值＞0.4,运行目标靶点基因的蛋白互作分析,下载保存结果。将结果导入生物信息网络构建分析工具Cytoscape软件,构建目标靶点的蛋白互作网络,根据各靶点基因在网络中的连接度进行关键靶点的筛选。

1.4 中药-有效活性成分-疾病靶点调控网络构建分析 整理前述获得的金匮肾气丸药物组成、筛选的有效活性成分及与其存在直接作用关系的PMOP治疗靶点,导入Cytoscape构建中药-有效活性成分-疾病靶点调控网络,整体分析调控网络,疏理金匮肾气丸防治PMOP的物质基础及其作用关系。

2 结果

2.1 金匮肾气丸组方有效活性成分及其疾病靶点将金匮肾气丸组方中的8味中药分别输入TCMSP中,根据OB＞30%、DL＞0.18的药动学参数标准进行筛选,最终获得有效活性成分茯苓6个、附子6个、桂枝5个、牡丹皮6个、山药12个、山茱萸12个、熟地黄2个、泽泻7个。排除不同药物间重复的有效活性成分,最终获得金匮肾气丸有效活性成分47个,对应的治疗靶点105个。

2.2 金匮肾气丸治疗PMOP的目标靶点 从Gene Cards及CTD数据库检索获得PMOP治疗靶点分别为1 073个与12 385个,与上述获得的105个金匮肾气丸治疗靶点互相映射,最终获得金匮肾气丸治疗PMOP的目标靶点60个,可以认为金匮肾气丸的有效活性成分即是通过对此60个目标靶点所参与的生物学过程进行调控,进而发挥其治疗PMOP的作用。

2.3 目标靶点蛋白互作网络与关键靶点 将获得的60个金匮肾气丸治疗PMOP的目标靶点基因整理上传至STRING网站,运行蛋白互作PPI分析,将分析结果导入Cytoscape软件,构建目标靶点蛋白互作网络,并使用Cytohubba插件进行各靶点基因在网络中的连接度Degree值计算,筛选其中Degree值最高的前10位靶点基因,结果见图1。如图A所示,目标靶点基因间存在较密切的互作关系,共同构成复杂的互作网络。根据各目标靶点与其他靶点基因之间的连接关系计算其连接度Degree值,排名最高的前10位靶点基因为IL6(48)、ESR1(39)、VEGFA(39)、EGFR(39)、MYC(38)、MAPK8(37)、CASP3(36)、CCND1(35)、AR(32)及PPARG(30)。这10个靶点基因在目标靶点蛋白互作网络中与众多靶点存在连接作用,是金匮肾气丸治疗PMOP的关键靶点,可能参与重要的生物学功能活动。

图1 目标靶点PPI网络

2.4 中药-有效活性成分-疾病靶点调控网络 整理金匮肾气丸组方中的8味中药、筛选获得的47个有效活性成分及60个对应的PMOP目标靶点,导入Cytoscape软件,构建中药-有效活性成分-目标靶点调控网络,结果见图2。金匮肾气丸中的8味中药与筛选获得的47个有效活性成分之间以边线相连,牡丹皮、山药、山茱萸等与较多的有效活性成分相连,与其筛选获得较多有效活性成分的结果相对应,活性成分与目标靶点之间形成复杂调控网络,体现了中医药治疗作用的多成分、多靶点、复杂网络作用特点。

图2 金匮肾气丸-有效活性成分-目标靶点调控网络

3 讨论

人类生长发育依赖于肾精的充养,《素问·上古天真论》言:“女子七岁,肾气盛,齿更发长……四七,筋骨坚……七七,任脉虚,太冲脉衰少,天癸竭,地道不通,故形坏而无子也。”可以认为肾精即是人体生命活动的物质基础,女性绝经后肾精亏虚,故而出现PMOP。中医药治疗PMOP当以补肾填精为根本大法。金匮肾气丸具有补肾、益精、温阳之功,广泛应用于治疗肾阳虚型PMOP,但该药物是如何发挥其治疗作用目前仍需进一步研究。

本研究结合中医辨证论治观点与现代系统生物学理论方法,借助中药系统药理学分析工具TCMSP网站筛选金匮肾气丸组方中的有效活性成分,同时借助Gene Cards、CTD等人类疾病基因数据库获得PMOP的疾病靶点基因,经过互相映射,最终获得金匮肾气丸治疗PMOP的有效活性成分及与其作用的靶点基因。中药有效活性成分是中药经口服被人体吸收后真正发挥药理学作用的物质,是发挥中药治疗作用的基础物质；而疾病靶点基因则是药物直接作用的靶点,靶点基因所参与的生物学过程、所在的信号通路,以各不相同的靶点基因携带、转导、完成相应生命活动所需的遗传信息。病理情况下相应靶点基因的生物学功能活动发生异常,需要针对靶点基因进行调控,以恢复正常生理学功能。中药的有效活性成分与相应疾病靶点基因是中药治疗疾病的物质基础,其治疗作用是基于活性成分调控疾病靶点基因的生物学功能实现的。

本研究针对获得的PMOP治疗靶点,进行了目标靶点的蛋白互作分析与网络构建。从PPI网络可知,PMOP疾病靶点之间存在较为密切的联系网络,各靶点间连接广泛,提示PMOP的发生是由多靶点共同调控,发病机制较为复杂。在PPI网络中筛选获得的IL6、ESR1、AR、MAPK8等关键靶点,共同参与机体的雌激素受体活动、雄激素受体活动、丝裂原活化蛋白激酶信号通路、破骨细胞分化等生物学活动或通路机制[9-11]。上述靶点是与PMOP发病过程中骨重建-骨吸收稳态调控存在直接关联作用的重要靶点。从金匮肾气丸-有效活性成分-PMOP目标靶点调控网络可知,金匮肾气丸对PMOP的治疗存在多成分、多靶点、复杂网络调控的作用特点,这与中医药从整体及发病之本进行治疗的理念相符。

综上所述,本研究初步明确了金匮肾气丸中的有效活性成分及其作用靶点,但各靶点基因参与的具体生物学过程及其在各种通路机制中发挥的作用目前尚不明确；另一方面,金匮肾气丸发挥治疗作用的物质基础(组方中的有效活性成分),在目标靶点参与的生物学过程中是如何进行调控的,也仍需进一步探索。