基于UHPLC-Q-Orbitrap HRMS 快速鉴定桂枝中水溶性成分

刘 瑞，泰 刚，王 瑞，张淑蓉

（1.山西中医药大学，山西 晋中 030619；2.山西省食品药品检验所，山西 太原 030001）

桂枝为樟科植物肉桂Cinnamomum cassia Presl 的干燥嫩枝［1］，味辛、甘，性温，具有发汗解肌、温通经脉、助化阳气、平冲降气等功效，在临床上多用于风寒感冒、脘腹冷痛、血寒经闭、关节痹痛、痰饮、水肿、心悸、奔豚等［2-3］。桂枝临床应用广泛，常与白术、麻黄、桃仁、芍药和附子等配伍，其中用于治疗风寒表虚证的桂枝汤因其组方严谨，力效专宏而被誉为张仲景“群方之冠”。

目前桂枝的研究主要集中在桂枝中肉桂酸、肉桂醛等简单苯丙素类成分的研究及药理作用方面，对桂枝中黄酮、木脂素和苷类等其他化学成分研究较少［4-5］。临床应用中，桂枝多以汤剂形式用药，汤剂中所含成分复杂，且主要为水溶性成分，因此本文采用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道肼高分辨质谱技术（ultrahigh performanceliquid chromatography-quadrupole/orbitrapmass spectrometry，UHPLC-Q/Orbitrap HRMS）对桂枝水提液的化学成分进行研究。通过高分辨质谱数据解析，并结合对照品对照、质谱裂解规律和相关文献检索等共鉴定出20 个水溶性化合物，为进一步深入阐明桂枝的药效物质基础、配伍机制及临床应用等相关研究奠定基础。

1 仪器与试药

Dionex Ultimate 3000 二元超高压液相色谱系统，Thermo Scientific Q-Exactive Focus 质谱仪，电喷雾离子源，Xcalibur 工作站（美国Thermo Scientific 公司），BT25 电子分析天平（德国Sartorius）。

桂枝购自山西省太原市同仁堂大药房（产地广西），经山西中医药大学中药与食品工程学院裴香萍副教授鉴定为樟科植物桂枝的干燥嫩枝。肉桂酸（批号：180824），购买于上海融禾医药科技有限公司，纯度≥98%。乙腈（色谱纯，美国赛默飞公司），甲酸（色谱纯，天津科密欧试剂有限公司），水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与质谱条件

色谱条件：Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm ID，1.7 μm）；流动相为0.1%甲酸水（A）和乙腈（B），梯度洗脱程序为：0～13 min，5%B～15%B；13～17 min，15%B；17～25 min，15%B～85%B；25～30 min，85%B。柱温30 ℃，进样量2 μL，流速0.2 mL/min。

质谱条件：电喷雾离子源，鞘气和辅助气为高纯氮气，碰撞气体为高纯氦气，喷雾电压正离子模式下为3.5 kV，负离子模式下为2.5 kV，离子传输管温度300 ℃，辅助气加热温度320 ℃，射频透镜电压50 V。质量扫描范围为m/z 100～1500，正负离子切换扫描，一级质谱全扫描结合数据依赖性二级质谱扫描，分辨率：MS1-70 000 FWHM，MS2-17 500 FWHM，高能量碰撞解离（HCD）。

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液的制备 取桂枝9 g 置于圆底烧瓶中，加入10 倍量的水浸泡30 min，回流提取1 h，过滤；残渣再加入10 倍量的水回流提取1 h，过滤。合并2 次滤液，加热浓缩至9 mL（约含生药1 g/mL）。取溶液1 mL，加50%甲醇溶液10 mL 稀释后，摇匀，0.22 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.2 对照品溶液的制备 取肉桂酸对照品适量，精密称定，加50%甲醇水制成浓度10 μg/mL的溶液，备用。

2.3 桂枝中水溶性成分解析

桂枝水提液在“2.1 项”色谱和质谱条件下得到的总离子流图，见图1。根据Q-Orbitrap 高分辨质谱的一级质谱中化合物的准分子离子、加和离子等信息推测精确分子量，Xcalibar 4.0 软件在5 ppm质量偏差范围内拟合其分子式；再根据二级质谱中碎片离子、裂解规律以及与对照品、参考文献、PubChem、massbank 等数据库比对等方式对化学成分的推导鉴定和确证。最终，从桂枝水提液中鉴定了20 个化学成分，其中部分化学成分的结构式见图2，鉴定结果见表1。

化合物2 准分子离子峰m/z 153.018 1［M-H］-，Xcalibar 软件拟合并推测其最可能的分子式为C7H6O4，二级质谱中生成m/z 109.03［M-H-CO2］-，结合文献［6］鉴定化合物2 为原儿茶酸。化合物1准分子离子峰m/z 315.072 6［M-H］-，推测其最可能的分子式为C13H16O9，二级质谱中失去1 分子六碳糖C6H10O5（162 Da）生成碎片离子m/z 153.02，并继续失去1 分子CO2生成m/z 109.03，因此推测化合物1 为原儿茶酸葡萄糖苷。

图1 桂枝总离子流图（A：负离子模式；B：正离子模式）

图2 桂枝中部分化学成分的结构式

图3 肉桂醇苷裂解规律

表1 UHPLC-Q-Orbitrap-HRMS 鉴定桂枝的化学成分

化合物3 准分子离子峰为137.023 1［M-H］-，推测其分子式为C7H6O3。二级质谱中形成碎片离子m/z 119.02［M-H-H2O］-，m/z 109.02［M-H-CO］-，根据文献［7］和MassBank 数据库，推测其为对羟基苯甲酸。

化合物4 和5 的保留时间分别为8.81 和10.90 min，在负离子模式下准分子离子峰均为m/z 289.072 2［M-H］-，正离子模式下准分子离子峰均为m/z 291.086 5［M+H］+，故确定化合物的分子量为290，软件拟合其分子式为C15H14O6。两个化合物的二级质谱碎片离子相同，均形成m/z 245［M-H-CO2］-，且形成m/z 125.02 1，4A-，1，3A m/z 137.02-，1，2Am/z 165.02 和［M-H-B 环］-m/z 179.03 等4 个儿茶素类化合物的特征性离子［8］，故推测化合物4 和5分别为儿茶素和表儿茶素。

化合物6 的保留时间为11.44 min，负离子模式下准分子离子峰为m/z 327.108 6［M-H］-，655.225 0［2M-H］-，确定其分子量为328，软件拟合其分子式为C15H20O8。二级质谱中生成m/z 165.05［M-H-Glu］-，m/z 121.06［M-H-Glu-CO2］-，根据其裂解规律和文献［9］推测其为二氢肉桂苷。

化合物7 和16 二者准分子离子峰均为m/z 165.054 79［M+H］＋，二级质谱中失去1 分子H2O生成m/z 147.04 碎片，继续丢失1 分子CO 生成m/z 119.04，丢失1 分子CO 生成m/z 91.05 碎片，且比肉桂酸分子量多16，故推断化合物6 和17为羟基肉桂酸及其异构体。桂枝中含有较多的肉桂酸、羟基肉桂酸等具有C6～C3结构的苯丙素类化合物及其衍生物，其二级质谱中易脱去H2O、CO、CO2等小分子产生相应的碎片离子峰。

化合物8 和9 互为同分异构体，二者准分子离子峰为m/z 581.224 7［M-H]-，m/z 627.230 1［MH+COOH]-，确定相对分子量为582，软件拟合其分子式为C28H38O13。二级质谱中脱去1 分子葡萄糖（162 Da）生成苷元离子m/z 419.171 4。继而生成m/z 404.15［M-H-CH3］-，m/z 401.16［M-H-H2O］-，m/z 389.12［M-H-2CH3］-，m/z 373.13［M-H-H2O-CO］-，m/z 359.11［M-H-4CH3］-等碎片离子，根据以上数据并参考文献［10-11］将其指认为（+）南烛木树脂酚-3α-O-β-D-葡萄糖苷和（-）-4-epi-南烛木树脂酚-3α-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物10 的保留时间为14.52 min，负离子模式下准分子离子峰为m/z 303.051 36［M-H］-，拟合其分子式为C15H12O7。其二级质谱图中生成m/z 285.04［M-H-H2O］-、m/z 275.05[M-H-CO］，m/z 259［M-H-CO2］-，m/z 241［M-H-CO2-H2O］-和C 环发生RDA 裂解生成m/z 125（A1，4-）等碎片离子。通过查阅文献［12］，该化合物的质谱裂解规律符合二氢槲皮素的结构特点，因此鉴定化合物10 为二氢槲皮素。

化合物11 的保留时间为14.76 min，负离子模式下准分子离子峰为m/z 427.161 2［M-H］-，m/z 473.166 8［M-H+HCOOH］-，软件拟合其分子式为C20H28O10。根据其裂解规律推测为肉桂醇苷（络塞维），二级质谱中m/z 293.08 为母离子失去1 分子肉桂醇生成，m/z 133.06 为母离子失去结构中的阿拉伯糖和葡萄糖形成的苷元肉桂醇，裂解规律见图3。另可见阿拉伯糖（Ara）碎片离子131.03［Ara-HH2O］-、113.02［Ara-H-2H2O］-和葡萄糖（Glu）碎片离子161.04［Glu-H-H2O］-、143.03［Glu-H-H2OH2O］-、131.03［Glu-H2O-CH2O-H］-、119.03［Glu-H2O-C2H2O-H］-和113.02［Glu-H2O-CH2O-H2O-H］-。

化合物13 负离子模式下准分子离子峰为m/z 429.177 3［M-H］-，其分子式为C20H30O10，比化合物11 分子量多2 Da，其二级质谱中生成297.13［M-H-Ara］-，同时也生成阿拉伯糖（Ara）和葡萄糖（Glu）碎片离子相应的碎片离子。络塞维苷元肉桂醇结构中含有一个双键，故推断化合物13 为二氢络塞维。化合物12 和14 分别为络塞维和二氢络塞维的顺反异构体。

化合物18 保留时间为20.30 min，负离子模式下准分子离子峰为m/z 147.043 91［M-H］-，二级质谱裂解形成m/z 131.05［M+H-CO］-、m/z 103.05［M+H-CO2］-；正离子模式下准分子离子峰为m/z 149.059 9［M+H］＋，二级质谱裂解形成m/z 131.05［M+H-H2O］+、m/z 103.05［M+H-H2O-CO］＋的碎片离子，其质谱裂解规律和文献中肉桂酸相同［13］，并进一步通过与对照品比对，确认化合物18 为肉桂酸。

化合物15、17 和19 依此规律分别鉴定为甲氧基肉桂酸、香豆素和甲基肉桂酸。

化合物20 的保留时间为24.15 min，负离子模式下准分子离子峰为m/z 295.097 6［M-H］-，推测其最可能的分子式为C28H38O13。二级质谱中脱去1 分子H2O 生成碎片离子m/z 277.09，继而丢失1 分子CO2生成碎片离子m/z 233.10，根据其质谱裂解规律，并参照文献［14］暂定化合物20 为（3-methoxy-5H-9，11-dioxabenzo［3，4］-cyclohepta-［1，2-f］-iden-7-yl）metahnol。

3 讨论

中药为公认的复杂体系，其整体药效表征具有多成分、弱效应、协调整合作用等特点。繁杂多样的化学成分是中药及其方剂发挥多种药理活性的物质基础。随着现代仪器分析技术的快速发展，液质联用技术把色谱的高分离性能和质谱的高选择性、高灵敏度及碎片离子重现性好的优点结合起来［15］，已被广泛用于中药及其制剂的研究，极大地推动了中药现代化的发展。

本研究采用超高效液相色谱-四级杆/静电场轨道肼高分辨质谱对桂枝药材水煎液的成分进行了较为全面的分析，基于化合物的精确分子量、裂解特征、相关数据库和参考文献，鉴定了桂枝药材水煎液中20 种化合物，包括苯丙素、苯丙素苷、木脂素、黄酮、倍半萜和小分子有机酸等多种类型的化合物，研究结果为进一步阐明桂枝及其方剂的药效物质及作用机制提供了科学的依据。